Ткань Подготовка и иммуностоирование мыши Craniofacial тканей и недекализированных костей
Summary
Здесь мы представляем подробный протокол для обнаружения и количественной оценки уровня белка во время черепно-мозгового морфогенеза / патогенеза путем иммуносохранения с помощью мыши черепно-лицевой ткани в качестве примеров. Кроме того, мы описываем метод приготовления и криоотделения недекальцифицированных твердых тканей у молодых мышей для иммунодефицита.
Abstract
Ткань иммуностоинга обеспечивает высокоспецифическое и надежное обнаружение белков, представляющих интерес в данной ткани. Здесь мы описываем полный и простой протокол для обнаружения экспрессии белка во время черепно-мозгового морфогенеза/ патогенеза с использованием мышичерепных тканей в качестве примеров. Протокол состоит из подготовки и криоотделения тканей, косвенной иммунофлуоресценции, приобретения изображения и количественной оценки. Кроме того, описан метод подготовки и криоотделения недекальцифицированных твердых тканей для иммуностоинга, в качестве примеров используется черепно-мозговая ткани и длинные кости. Эти методы являются ключевыми для определения экспрессии белка и морфологических / анатомических изменений в различных тканях во время черепно-мозгового морфогенеза / патогенеза. Они также применимы к другим тканям с соответствующими изменениями. Знание гистологии и высокое качество разделов имеют решающее значение для того, чтобы сделать научные выводы из экспериментальных результатов. Потенциальные ограничения этой методологии включают, но не ограничиваются спецификой антител и трудностями количественной оценки, которые также обсуждаются здесь.
Introduction
Лицо является ключевой частью человеческой идентичности, и состоит из нескольких различных типов тканей, таких как эпителий, мышцы, кости, хрящи, зуб. Эти ткани являются производными от всех трех слоев зародыша: эктодерм, эндодерм, и мезодерм1,2. Для правильного узорства и развития черепно-мозговых тканей, пролиферации клеток, смерти и дифференциации должны быть высоко скоординированы и регулируются конкретными сигнальными путями, такими как Wnt, Fgf, Hh и Bmp пути3,4 ,5. Дефекты пролиферации, выживания или дифференциации клеток приведут к черепно-мозговым порокам развития, которые являются одними из наиболее часто встречающихся врожденных дефектов. Трансгенные мыши являются полезными инструментами дляизучения механизмов краниофациального морфогенеза и патогенеза1,2,3,4. Понимание изменений в черепно-мозговых структурах во время развития и патогенеза поможет прояснить ключевые принципы развития, а также механизмы черепно-мозговых пороковразвития1,2,3 ,4,5.
Окрашивание целых креплений или секционированных тканей с конкретными антителами является бесценным методом для определения пространственного распределения белков, представляющих интерес 6. Формально иммуностоидирование тканей может опираться либо на иммуногистохимию (IHC), либо на иммунофлуоресценцию (ИФ). По сравнению с непрозрачным продуктом реакции, генерируемым с хромогенным субстратом, таким как 3,3′-Диаминобензидин (DAB) IHC, IF включает в себя использование флуоресцентных конъюгатов, видимых флуоресценцией микроскопии. Таким образом, ЕСЛИ может четко дифференцировать положительные клетки от фонового шума, и позволяет изображения, которые будут количественно проанализированы и расширены в простой моды с помощью программного обеспечения, таких как ImageJ и Adobe Photoshop7,8. Весь подход крепления окрашивания работает на небольших блоках ткани (толщиной менее 5 мм), которые могут предоставить трехмерную информацию о расположении белков/антигенов без необходимости реконструкции из разделов9,10 . Однако, по сравнению с секциями тканей, цельное иммуносирование монтирует много времени и требует больших объемов антител. Не все антитела совместимы с основным подходом всего крепления. Кроме того, неполное проникновение антител приведет к неравномерному окрашиванию или ложному отрицательному окрашиванию. Здесь мы сосредоточимся на иммунофлуоресценции обнаружения белков / антигенов на разделенных тканей. Для твердых тканей (например, головы, зуба, длинной кости), осаждение кальция во время развития / патогенез делает образец трудно сечения и легко промыть во время иммуно-денсивного лечения11,12. Большинство имеющихся в настоящее время протоколов декальцифифицировать твердые ткани перед встраиванием, чтобы сделать секционирование легче, что отнимает много времени и может уничтожить морфологию и антигены образцов, если обращаться неправильно11,12. Чтобы преодолеть проблемы, мы оптимизировали подход к криоотделению твердых тканей без декальцинации, что привело к улучшению визуализации их морфологии и распространению сигнальных белков.
Описанный здесь протокол используется для определения морфометрических и гистологических изменений в черепно-мозговых тканях трансгенных мышей БМП. В частности, протокол включает в себя (1) уборку и вскрытие тканей головы, (2) раздел и иммуностонинг экспериментальных маркеров (Ki67, pSmad1/5/9) наряду с окрашиванием TUNEL, (3) визуализацией секций с использованием флуоресцентного микроскопа и, наконец, (4) анализ и количественная оценка результатов. Протокол для подготовки и криосецификации твердых тканей без декальцинации также описано13. Эти методы оптимизированы для черепно-мозговых тканей. Они также применимы к другим тканям разного возраста образцов с соответствующими модификациями.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы предоставляем подробный протокол для подготовки головы мыши и недекальцифицированных костных тканей, а также криосекции для иммуносточки зрения клеточной пролиферации, клеточной смерти и сигнальных маркеров БМП. Мы также подробно описываем стратегию получения количественн…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (R01DE020843 до Y.M.), Международной ассоциацией ФОП (Y.M.), а также грантом от Национального фонда естественных наук Китая (31500788 до J.Y.).
Materials
| Adhesive tape | Leica | #39475214 | |
| Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11034 | |
| Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| Coverslips | Fisher Brand | 12-545-E | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit | Millipore | S7165 | |
| Microscope slides | Fisher Brand | 12-550-15 | |
| OCT Compound | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Sigma | T9284 | Triton X-100 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2542 | |
| Rabbit anti-Ki67 antibody | Cell Signaling Technology | 9129 | Lot#:3; RRID:AB_2687446 |
| Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody | Cell Signaling Technology | 13820 | Lot#:3; RRID:AB_2493181 |
| Sodium citrate | Sigma | 1613859 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tris | Sigma | 10708976001 |
References
- Trinh, L. e. A., Fraser, S. E. Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning. Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).
- Marcucio, R., et al. Facial morphogenesis: physical and molecular interactions between the brain and the face. Current Topics in Developmental Biology. 115, 299-320 (2015).
- Graf, D., et al. Common mechanisms in development and disease: BMP signaling in craniofacial development. Cytokine & Growth Factor Reviews. 27, 129-139 (2016).
- Snider, T. N., Mishina, Y. Cranial neural crest cell contribution to craniofacial formation, pathology, and future directions in tissue engineering. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 102 (3), 324-332 (2014).
- Mishina, Y., Snider, T. N. Neural crest cell signaling pathways critical to cranial bone development and pathology. Experimental Cell Research. 325 (2), 138-147 (2014).
- Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
- Xiao, C., Dan-Bi, C. Double staining immunohistochemistry. North American Journal of Medical Sciences. 2 (5), 241-245 (2010).
- Zongli, Q., et al. Comparison of immunofluorescence and immunohistochemical staining with anti-insulin antibodies on formalin-fixed paraffin-embedded human pancreatic tissue microarray sections. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 10 (3), 3671-3676 (2017).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
- Dun, X. P., Parkinson, D. B. Whole mount immunostaining on mouse sciatic nerves to visualize events of peripheral nerve regeneration. Methods in Molecular Biology. 1739, 339-348 (2018).
- Akkiraju, H., et al. An Improved Immunostaining and Imaging Methodology to Determine Cell and Protein Distributions within the Bone Environment. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (3), 168-178 (2016).
- González-Chávez, S. A., et al. Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (10), 1972-1983 (2013).
- Kapelsohn, K. Improved Methods for Cutting, Mounting, and Staining Tissue for Neural Histology. Protocol Exchange. , (2015).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. (85), e50803 (2014).
- Shi, S. R., et al. Antigen retrieval techniques: current perspectives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (8), 931-937 (2001).
- Adell, T., et al. Immunohistochemistry on paraffin-embedded planarian tissue sections. Methods in Molecular Biology. 1774, 367-378 (2018).
- Griffioen, H. A., et al. Gelatin embedding to preserve lesion-damaged hypothalami and intracerebroventricular grafts for vibratome slicing and immunocytochemistry. Journal of Neuroscience Methods. 43, 43-47 (1992).
- Sarkar, S., et al. In situ demonstration of Fluoro-Turquoise conjugated gelatin for visualizing brain vasculature and endothelial cells and their characterization in normal and kainic acid exposed animals. Journal of Neuroscience Methods. 219 (2), 276-284 (2013).
- Oorschot, V., et al. A novel flat‐embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50, 1067-1080 (2002).
