הכנה לרקמה וכתמים של רקמות הגולגולת והעצמות הבלתי מתויטות
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי לזהות ולכמת את רמות החלבון במהלך הגולגולת מורפולגנזה/פתוגנזה על ידי מכתים באמצעות העכבר ברקמות הגולגולת כמו דוגמאות. בנוסף, אנו מתארים שיטה להכנה והקפאה של רקמות קשות בלתי מתויטות מעכברים צעירים לצורך חיסוני.
Abstract
חיסוני רקמות מספק זיהוי ספציפי ואמין מאוד של חלבונים של עניין בתוך רקמה נתונה. כאן אנו מתארים פרוטוקול שלם ופשוט כדי לזהות ביטוי חלבון במהלך הגולגולת מורפולגנזה/פתוגנזה באמצעות העכבר ברקמות הגולגולת כדוגמאות. הפרוטוקול כולל הכנה והקפאה של ממחטות נייר, אימונולואוורנציה עקיפים, רכישת תמונות וכימות. בנוסף, שיטה להכנה ולהקפאה של רקמות קשות בלתי מוצקות לשימוש חיסוני מתוארת, באמצעות רקמות הגולגולת ועצמות ארוכות כדוגמאות. שיטות אלה הן מפתח כדי לקבוע את ביטוי החלבון ואת השינויים מורפולוגיים/אנטומיים ברקמות שונות במהלך הגולגולת מורגנזה/פתוגנזה. הם חלים גם על רקמות אחרות עם שינויים מתאימים. הידע של היסטולוגיה ואיכות גבוהה של סעיפים הם קריטיים כדי להסיק מסקנות מדעיות מתוצאות ניסיוני. מגבלות פוטנציאליות של מתודולוגיה זו כוללות אך אינן מוגבלות לספציפיות של נוגדנים וקשיי כימות, הנדונים גם כאן.
Introduction
הפנים הוא חלק מרכזי של הזהות האנושית, והוא מורכב מכמה סוגים שונים של רקמות, כגון אפיתל, שריר, עצם, סחוס, השן. הרקמות הללו נגזרות מכל שלוש שכבות הנבט: העור, האנדועור, ומזועור1,2. עבור מעצבים הנכון ופיתוח של רקמות הגולגולת, התפשטות התא, מוות ובידול צריך להיות מתואם מאוד מוסדר על ידי מסלולים מסוימים איתות, כגון wnt, fgf, Hh ו Bmp מסלולים3,4 ,5. פגמים בהפצה, הישרדות או הבדלה של תאים יוביל להמומים הגולגולת, אשר הם בין פגמים לידה מולדים הנפוץ ביותר. עכברים טרנסגניים הם כלים שימושיים כדי לחקור מנגנונים של הגולגולת מורפוגנזה ו פתוגנזה1,2,3,4,5. הבנת השינויים במבני הגולגולת במהלך הפיתוח והפתוגנזה תסייע להבהיר עקרונות התפתחותיים מרכזיים, כמו גם את המנגנונים של מומים הגולגולת1,2,3 ,4,5.
ההכתים של הר שלם או רקמות מנות עם נוגדנים ספציפיים היא טכניקה לא יסולא בפז לקביעת התפלגות מרחבית של חלבונים של ריבית 6. באופן רשמי, חיסוני רקמות יכול להסתמך על כימיה אימונוהיסטוכימיה (IHC) או אימונולואואורנציה (IF). בהשוואה למוצר התגובה האטום שנוצר עם המצע כרומוגניים כגון 3, 3 ‘-Diaminobenzidine (בתוספת) על ידי IHC, אם כרוך השימוש של שערים פלורסנט גלוי על ידי מיקרוסקופ ניאון. לכן, אם ניתן בבירור להבדיל בין תאים חיוביים לרעשי רקע, ומאפשרת לתמונות להיות מנותחות ומשופרות בצורה פשוטה באמצעות תוכנה כגון imagej ו-Adobe Photoshop7,8. הגישה כל הר מכתים עובד על בלוקים קטנים של רקמה (פחות מ 5 מ”מ עבה), אשר יכול לספק מידע תלת מימדי על המיקום של חלבונים/אנטיגנים ללא צורך שחזור מסעיפים9,10 . עם זאת, לעומת מקטעי רקמות, חיסוני כל הר כל הוא זמן רב ודורש כמויות גדולות של פתרונות נוגדן. לא כל הנוגדנים תואמים את כל הגישה הבסיסית של הר. בנוסף, החדירה הלא מלאה של נוגדנים תגרום לצביעת לא אחיד או כתמים שליליים שווא. כאן נתמקד בזיהוי של חלבונים/אנטיגנים ברקמות הסנות. עבור רקמות קשות (למשל, ראש, שיניים, עצם ארוך), התצהיר סידן במהלך פיתוח/פתוגנזה עושה את המדגם קשה סעיף בקלות לשטוף את במהלך טיפול חיסוני11,12. רוב הפרוטוקולים הזמינים הנוכחי decalcify רקמות קשות לפני הטבעה כדי להפוך את הפחתת קל יותר, וזה זמן רב והוא יכול להרוס מורפולוגיה ואנטיגנים של דגימות אם מטופלים כראוי11,12. כדי להתגבר על הסוגיות, אנו אופטימיזציה גישה להקפאה של רקמות קשות ללא decalcification, המוביל ויזואליזציה משופרת של המבנה שלהם והפצה של חלבונים איתות.
הפרוטוקול המתואר כאן משמש כדי לקבוע שינויים מורמטרים והיסטולוגית ברקמות הגולגולת של עכברים טרנסגניים BMP. באופן ספציפי, הפרוטוקול כולל (1) קצירת וניתוח רקמות הראש, (2) מקטע ומכתים של סמנים ניסיוניים (Ki67, pSmad1/5/9) יחד עם כתמים TUNEL, (3) הדמיה סעיפים באמצעות מיקרוסקופ הזריחה, ולבסוף (4) ניתוח וכימות התוצאות. הפרוטוקול להכין ולקריוחלק רקמות קשות ללא decalcification מתואר גם13. שיטות אלו ממוטבות לרקמות הגולגולת. הם חלים גם על רקמות אחרות מגילאים שונים של דגימות עם שינויים מתאימים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט להכנת ראש העכבר ורקמות העצם הבלתי מתויטות, והקפאה להכתמים של הפצת תאים, מוות תאים, ו-BMP איתות סמנים. כמו כן, אנו מפרטים את האסטרטגיה להשגת נתונים כמותיים מתמונות מאימונולווקארדורף. שיטות אלה יכולות גם להיות ישימות על רקמות אחרות עם שינויים מתאימים.
<p class="jove_con…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות (R01DE020843 to Y.M.), האגודה הבינלאומית FOP (Y.M.), ו מענק סיוע מתוך הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31500788 לJ.Y.).
Materials
| Adhesive tape | Leica | #39475214 | |
| Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11034 | |
| Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| Coverslips | Fisher Brand | 12-545-E | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit | Millipore | S7165 | |
| Microscope slides | Fisher Brand | 12-550-15 | |
| OCT Compound | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Sigma | T9284 | Triton X-100 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2542 | |
| Rabbit anti-Ki67 antibody | Cell Signaling Technology | 9129 | Lot#:3; RRID:AB_2687446 |
| Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody | Cell Signaling Technology | 13820 | Lot#:3; RRID:AB_2493181 |
| Sodium citrate | Sigma | 1613859 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tris | Sigma | 10708976001 |
References
- Trinh, L. e. A., Fraser, S. E. Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning. Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).
- Marcucio, R., et al. Facial morphogenesis: physical and molecular interactions between the brain and the face. Current Topics in Developmental Biology. 115, 299-320 (2015).
- Graf, D., et al. Common mechanisms in development and disease: BMP signaling in craniofacial development. Cytokine & Growth Factor Reviews. 27, 129-139 (2016).
- Snider, T. N., Mishina, Y. Cranial neural crest cell contribution to craniofacial formation, pathology, and future directions in tissue engineering. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 102 (3), 324-332 (2014).
- Mishina, Y., Snider, T. N. Neural crest cell signaling pathways critical to cranial bone development and pathology. Experimental Cell Research. 325 (2), 138-147 (2014).
- Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
- Xiao, C., Dan-Bi, C. Double staining immunohistochemistry. North American Journal of Medical Sciences. 2 (5), 241-245 (2010).
- Zongli, Q., et al. Comparison of immunofluorescence and immunohistochemical staining with anti-insulin antibodies on formalin-fixed paraffin-embedded human pancreatic tissue microarray sections. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 10 (3), 3671-3676 (2017).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
- Dun, X. P., Parkinson, D. B. Whole mount immunostaining on mouse sciatic nerves to visualize events of peripheral nerve regeneration. Methods in Molecular Biology. 1739, 339-348 (2018).
- Akkiraju, H., et al. An Improved Immunostaining and Imaging Methodology to Determine Cell and Protein Distributions within the Bone Environment. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (3), 168-178 (2016).
- González-Chávez, S. A., et al. Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (10), 1972-1983 (2013).
- Kapelsohn, K. Improved Methods for Cutting, Mounting, and Staining Tissue for Neural Histology. Protocol Exchange. , (2015).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. (85), e50803 (2014).
- Shi, S. R., et al. Antigen retrieval techniques: current perspectives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (8), 931-937 (2001).
- Adell, T., et al. Immunohistochemistry on paraffin-embedded planarian tissue sections. Methods in Molecular Biology. 1774, 367-378 (2018).
- Griffioen, H. A., et al. Gelatin embedding to preserve lesion-damaged hypothalami and intracerebroventricular grafts for vibratome slicing and immunocytochemistry. Journal of Neuroscience Methods. 43, 43-47 (1992).
- Sarkar, S., et al. In situ demonstration of Fluoro-Turquoise conjugated gelatin for visualizing brain vasculature and endothelial cells and their characterization in normal and kainic acid exposed animals. Journal of Neuroscience Methods. 219 (2), 276-284 (2013).
- Oorschot, V., et al. A novel flat‐embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50, 1067-1080 (2002).
