마우스 두개안면 조직 및 분해되지 않은 뼈의 조직 준비 및 면역 염색
Summary
여기에서, 우리는 마우스 두개안면 조직을 사용하여 면역 염색에 의해 두개안면 형태 형성/병인 동안 단백질 수준을 검출하고 정량화하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 또한, 우리는 면역 염색을 위한 젊은 마우스에게서 decalcified 되지 않은 단단한 조직의 준비 그리고 저온 절제를 위한 방법을 기술합니다.
Abstract
조직 면역 염색은 주어진 조직 내의 관심 있는 단백질의 고도로 특이하고 믿을 수 있는 검출을 제공합니다. 여기에서 우리는 예를 들면 마우스 두개안면 조직을 사용하여 두개안면 형태 형성/병인 도중 단백질 발현을 검출하는 완전하고 간단한 프로토콜을 기술합니다. 프로토콜은 조직의 준비 및 냉동 부피, 간접 면역 형광, 이미지 수집 및 정량화로 구성됩니다. 또한 면역 염색을위한 비해짐 경조직의 준비 및 냉동 절제 방법은 두개안면 조직과 긴 뼈를 예로 들수 있습니다. 그 방법은 두개안면 형태 형성/병인 동안 다양한 조직에서 단백질 발현 및 형태학적/해부학적 변화를 결정하는 데 핵심적인 것입니다. 그(것)들은 또한 적당한 수정을 가진 그밖 조직에 적용가능합니다. 연구 결과에 대한 지식과 섹션의 높은 품질은 실험 결과에서 과학적 결론을 도출하는 데 중요합니다. 이 방법론의 잠재적 한계는 항체의 특이성 및 정량화의 어려움에 한정되지 않으나, 이는 또한 여기에서 논의된다.
Introduction
얼굴은 인간 정체성의 중요한 부분이며 상피, 근육, 뼈, 연골, 치아와 같은 여러 가지 유형의 조직으로 구성됩니다. 그 조직은 모든 3개의 세균 층에서 파생됩니다: ectoderm, 내배엽및 중배엽 1,2. 두개안면 조직의 적절한 패터닝 및 개발을 위해서는 Wnt, Fgf, Hh 및 Bmp 경로3,4와 같은 특정 신호 경로에 의해 세포 증식, 사망 및 분화가 고도로 조정되고 조절되어야 합니다. ,5. 세포의 증식, 생존 또는 분화의 결함은 가장 자주 발생하는 선천성 선천성 선천적 인 결함 중 하나 인 두개안면 기형으로 이어질 것입니다. 형질전환 마우스는 두개안면 형태 형성 및 병인의 메커니즘을연구하는 데 유용한 도구1, 2,3,4,5. 발달과 병인 동안 두개안면 구조의 변화를 이해하는 것은 주요 발달 원리뿐만 아니라 두개안면 기형의 메커니즘을 명확히하는 데 도움이 될 것입니다1,2,3 ,4,5.
특정 항체를 가진 전체 마운트 또는 단면 조직의 염색은 관심 있는 단백질의 공간 분포를 결정하기 위한 귀중한 기술이다 6. 공식적으로, 조직 면역 염색은 면역 조직 화학 (IHC) 또는 면역 형광 (IF)에 의존 할 수 있습니다. IHC에 의해 3,3′-디아미노벤지딘(DAB)과 같은 발색성 기질로 생성된 불투명 반응 생성물과 비교하여, IF는 형광 현미경 검사법에 의해 보이는 형광 접합체의 사용을 포함한다. 따라서 IF는 배경 잡음으로부터 양성 세포를 명확하게 구별할 수 있으며, ImageJ 및 Adobe Photoshop7,8과같은 소프트웨어에 의해 이미지를 정량적으로 분석하고 향상시킬 수 있다. 전체 마운트 염색 접근법은 작은 조직 블록 (두께 5mm 미만)에서 작동하며섹션9, 10에서 재건 할 필요없이 단백질 / 항원의 위치에 대한 3 차원 정보를 제공 할 수있습니다. . 그러나, 조직 단면도와 비교해, 전체 마운트 면역 염색은 시간이 오래 걸리고 항체 해결책의 대량을 요구합니다. 모든 항체가 기본 전체 마운트 접근법과 호환되는 것은 아닙니다. 또한, 항체의 불완전한 침투는 고르지 못한 염색 또는 거짓 음성 염색을 초래할 것이다. 여기에서 우리는 단면조직에 단백질/항원의 면역형광 검출에 집중할 것입니다. 단단한 조직(예를 들어, 머리, 치아, 긴 뼈)의 경우, 발달/병인 동안 칼슘 침착은 면역 염색 치료 동안 시료를 단면화하기 어렵게 하고 쉽게 헹구게 한다11,12. 현재 이용 가능한 대부분의 프로토콜은 절편을 쉽게 하기 위해 삽입하기 전에 단단한 조직을 decalcify, 이는 시간이 많이 걸리고 부적절하게 처리하는 경우 샘플의 형태 및 항원을 파괴 할 수있다11,12. 문제를 극복하기 위해, 우리는 decalcification없이 단단한 조직의 냉동 절제에 대한 접근 방식을 최적화, 그들의 형태와 신호 단백질의 분포의 개선 시각화로 이어지는.
여기서 기술된 프로토콜은 BMP 형질전환 마우스의 두개안면 조직에서 형태측정 및 조직학적 변화를 결정하는 데 사용되고 있다. 구체적으로, 이 프로토콜은 (1) 두체 조직을 수확및 해부하는 것, (2) 실험 마커의 절편 및 면역염색(Ki67, pSmad1/5/9)과 TUNEL 염색, (3) 형광 현미경을 사용하여 단면을 이미징하고, 마지막으로 (4) 결과를 분석하고 정량화합니다. 탈석없이 경조직을 준비하고 저온절하는 프로토콜도기재되어있다. 그 방법은 두개안면 조직에 최적화되어 있습니다. 그(것)들은 또한 적당한 수정을 가진 견본의 각종 나이에서 그밖 조직에 적용가능합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 마우스 헤드 및 dedecalcified 뼈 조직의 준비를 위한 상세한 프로토콜을 제공하고, 세포 증식, 세포 사멸 및 BMP 신호 마커의 면역 염색을 위한 냉동 부피. 우리는 또한 면역 형광 이미지에서 정량적 데이터를 얻기위한 전략을 자세히 설명합니다. 그 방법은 또한 적절한 수정을 가진 그밖 조직에 적용될 수 있습니다.
조직 준비를위한 조건은 조직의 크기와 유형에 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 보건원 (R01DE020843 ~ Y.M.), 국제 FOP 협회 (Y.M.), 중국 국립 자연 과학 재단 (31500788 ~ J.Y.)의 보조금 지원으로 지원되었습니다.
Materials
| Adhesive tape | Leica | #39475214 | |
| Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11034 | |
| Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| Coverslips | Fisher Brand | 12-545-E | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit | Millipore | S7165 | |
| Microscope slides | Fisher Brand | 12-550-15 | |
| OCT Compound | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Sigma | T9284 | Triton X-100 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2542 | |
| Rabbit anti-Ki67 antibody | Cell Signaling Technology | 9129 | Lot#:3; RRID:AB_2687446 |
| Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody | Cell Signaling Technology | 13820 | Lot#:3; RRID:AB_2493181 |
| Sodium citrate | Sigma | 1613859 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tris | Sigma | 10708976001 |
References
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