阿斯蒂亚纳克斯胚胎的全原位杂交
Summary
该方案使胚胎阿斯蒂亚纳克斯的基因表达可视化。这种方法的发展目标是最大限度地提高基因表达信号, 同时最大限度地减少非特异性背景染色。
Abstract
近年来, 墨西哥盲人的基因组草案已经发布, 揭示了数千个基因的序列特征。此前对这一新兴模型系统的研究利用了全基因组的全面研究, 这些研究已经确定了许多与各种洞穴相关表型相关的定量性状位点 (qtl)。然而, 将感兴趣的基因与表型变化的遗传基础联系起来的能力仍然是一个重大的挑战。一种能够促进更深入地了解发育在多态进化中的作用的技术是全安装原位杂交。这项技术可以用来直接比较洞穴和地表居住形式之间的基因表达, 提名已建立的 qtl 基础的候选基因, 从下一代测序研究中识别感兴趣的基因, 或开发其他基因基于发现的方法。在本报告中, 我们提出了一个简单的协议, 并得到了灵活的清单的支持, 可以广泛适应, 远远超出所提出的研究系统。希望该议定书能够成为Astyanax社区内外的广泛资源。
Introduction
原位杂交是染色固定组织的常用方法, 可直观地显示基因表达模式1。这项技术已在其他传统的2和非传统3型模型系统中进行多年, 用于各种生物研究。但是, 要成功执行此过程, 需要执行几个步骤和试剂。对于从未使用过这种技术的调查人员来说, 由于涉及许多步骤, 启动这一过程可能会令人望而生畏。此外, 此过程的冗长性质可能会导致技术错误, 而对故障排除可能会很有挑战性。
本文的总体目标是介绍一种简单而直接的方法, 使这种杂交技术可供广大受众访问。为了减少错误的引入, 我们提出了一个简单的方法, 产生高质量的基因表达染色, 并最大限度地减少非特异性背景信号。此过程类似于在传统模型系统中开发的其他方法, 如daio rerio 4。在这里, 我们的目标是使用可下载的清单 (补充文件 1) 促进每个步骤的谨慎实施, 以促进协议的谨慎实施。这样做的理由是通过这一程序所涉及的许多步骤为组织提供便利。本文适用于有兴趣在胚胎发育过程中进行全安装原位杂交的研究人员, 但尚未进行该程序。对于Astyanax研究人员来说, 所选择的方法的优点是, 它已在紫鱼和表面鱼类形态中进行了测试和验证, 从而有助于比较表达分析。该方法可供研究人员在阿斯蒂亚纳克斯等系统的研究中使用。
Protocol
Representative Results
Discussion
由于 rna 容易降解, 该协议中最关键的步骤之一是 rna 探针的无菌合成。然而, 如果探头是精心生成的, 并提供了良好的结果, 它可以在随后的染色反应中重复使用。第二个关键步骤是仔细生产整个协议中使用的所有试剂。由于该协议涉及几天和许多小步骤, 因此必须准确地生产所有试剂, 并以无菌的方式储存。此外, 调查人员对协议中的每一步都进行仔细跟踪, 这一点至关重要。我们发现, 所提供的步…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者希望感谢格罗斯实验室的成员对这份手稿的有益评论。我们要感谢在2017年和2018年暑期实习期间使用这一礼仪的四名高中生, 其中包括克里斯汀·曹、迈克尔·沃登、阿基·李和大卫·恩万克沃。hl 在2017年夏季得到了 uc 生物 stem 研究金的支持。这项工作得到了国家科学基金会 (deb-1457630 至 jbg) 和国家牙科和颅面研究所 (nih;de025033 至 jbg)。
Materials
| 10 mL Serological Pipette | VWR | 89130-888 | |
| 1000 mL Filtration Unit | VWR | 89220-698 | |
| 15 mL Conical | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| 25 mL Serological Pipette | VWR | 89130-890 | |
| 250 mL Filtration Unit | VWR | 89220-694 | |
| 5 mL Serological Pipette | VWR | 89130-886 | |
| 50 mL Conical | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500 mL Filtration Unit | VWR | 89220-696 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 g |
| Blocking Solution | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 g |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
| DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
| Ethanol | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
| Glass dram vials | VWR | 66011-041 | 1 Dr |
| Glass Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
| HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 mL |
| Heparin | Sigma | H3393-25KU | |
| Magnesium Chloride-crystalline | Fisher Scientific | M33-500 | 500 g |
| Maleic Acid | Sigma | M0375-100g | 100g |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
| Molecular-grade Water (RNase-free) | VWR | 7732-18-5 | 500 mL |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3 kg |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| NBT Substrate powder | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 g |
| Normal Goat Serum | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
| Nutating Mixer | VWR | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500g | 500 g |
| PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
| Proteinase K (200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10 mL |
| Plastic Pipettes | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250 mL |
| Shaking Water Bath 12 L | VWR | 10128-126 | 12 L |
| Standard Analog Shaker | VWR | 89032-092 | |
| Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500 g |
| tRNA Yeast | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25 mg |
| Tween 20 | Sigma | P9416-50mL | 50 mL |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
| Lithium Chloride (LiCl) | Sigma-Aldrich | 203637-10G | 10 g |
References
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