Wholemount ibridazione In Situ per gli embrioni Astyanax
Summary
Questo protocollo permette la visualizzazione dell’espressione genica in embrionali Astyanax caverna. Questo approccio è stato sviluppato con l’obiettivo di massimizzare il segnale di espressione genica, riducendo al minimo una colorazione di fondo non specifici.
Abstract
Negli ultimi anni, è stato rilasciato un genoma di bozza per la caverna cieca messicano (Astyanax mexicanus), rivelando l’identità di sequenza per migliaia di geni. Ricerca priore in questo sistema modello emergente capitalizzati sulle indagini di genoma complete che hanno identificato numerosi loci di carattere ereditario quantitativo (QTL) associati con vari fenotipi di grotta-collegata. Tuttavia, la capacità di connettersi alla base ereditabile per cambiamento fenotipico di geni di interesse rimane una sfida significativa. Una tecnica che può facilitare la comprensione più profonda del ruolo di sviluppo in troglomorfiche evoluzione è intero-monta l’ibridazione in situ. Questa tecnica può essere implementata per confrontare l’espressione genica tra forme e superficie-caverne, nominare candidato geni alla base di QTL stabilito, identificare geni di interesse dagli studi di sequenziamento di nuova generazione o sviluppare altri direttamente approcci basati sulla scoperta. In questo rapporto, presentiamo un protocollo semplice, supportato da una lista di controllo flessibile, che può essere ampiamente adattato per l’uso ben oltre il sistema di studio presentato. Si spera che questo protocollo può servire come una vasta risorsa per la comunità di Astianatte e oltre.
Introduction
L’ibridazione in situ è un metodo comune per la colorazione di tessuti fissi per visualizzare gene expression pattern1. Questa tecnica è stata eseguita per anni in altri tradizionali2 e sistemi di modello non tradizionali3 , per una varietà di studi biologici. Tuttavia, diversi passi e reagenti sono necessari per eseguire correttamente questa procedura. Per i ricercatori che non hanno mai eseguito questa tecnica, dando inizio al processo può essere intimidatorio a causa i molti passaggi. Ulteriormente, la natura lunga di questa procedura si presta ad errori tecnici, che possono essere difficile da risolvere.
L’obiettivo generale di questo articolo è di presentare un metodo semplice e diretto che renderà accessibile ad un vasto pubblico questa tecnica di ibridazione. Per ridurre l’introduzione di errori, vi presentiamo un approccio diretto che produce alta qualità gene espressione macchiatura e riduce al minimo segnale di fondo non specifici. Questa procedura è simile ad altri approcci sviluppati in sistemi modello tradizionale, come Danio rerio4. Qui, ci proponiamo di facilitare l’implementazione attenta di ogni passo usando una lista scaricabile (Supplemental File 1), per promuovere attenzione l’attuazione del protocollo. La spiegazione razionale per questa operazione è quello di facilitare organizzazione attraverso i molti passaggi di questa procedura. Questo articolo è adatto per i ricercatori interessati a condurre l’ibridazione in situ del intero-supporto nello sviluppo di embrioni, ma non hanno ancora eseguito la procedura. Il vantaggio dell’approccio scelto per i ricercatori Astyanax è che è stato testato e dimostrato in caverna e superficie pesce morph, facilitando in tal modo l’analisi dell’espressione comparativa. Il metodo presentato può essere utilizzato dai ricercatori negli studi su Astyanax e altri sistemi.
Protocol
Representative Results
Discussion
A causa della vulnerabilità di RNA alla degradazione, una delle fasi più critiche nel protocollo riguarda la sintesi sterile della sonda RNA. Tuttavia, se una sonda è generata con attenzione e fornisce buoni risultati, può essere riutilizzato nelle successive reazioni di colorazione. Un secondo punto cruciale è la produzione accurata di tutti i reattivi utilizzati in tutto il protocollo. Poiché questo protocollo coinvolge diversi giorni e molti piccoli passi, è essenziale che tutti i reagenti sono accuratamente pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio lordo per utili commenti su questo manoscritto. Vogliamo riconoscere quattro studenti delle scuole superiori che hanno utilizzato questo protocollo durante stage estivi nel 2017 e 2018, tra cui Christine Cao, Michael Warden, Aki Li e David Nwankwo. HL è stato sostenuto da una borsa di studio UC biologia staminali durante l’estate del 2017. Quest’opera è stata sostenuta da sovvenzioni da parte della National Science Foundation (DEB-1457630 a JBG) e il National Institutes of Dental e Craniofacial Research (NIH; DE025033 a JBG).
Materials
| 10 mL Serological Pipette | VWR | 89130-888 | |
| 1000 mL Filtration Unit | VWR | 89220-698 | |
| 15 mL Conical | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| 25 mL Serological Pipette | VWR | 89130-890 | |
| 250 mL Filtration Unit | VWR | 89220-694 | |
| 5 mL Serological Pipette | VWR | 89130-886 | |
| 50 mL Conical | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500 mL Filtration Unit | VWR | 89220-696 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 g |
| Blocking Solution | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 g |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
| DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
| Ethanol | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
| Glass dram vials | VWR | 66011-041 | 1 Dr |
| Glass Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
| HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 mL |
| Heparin | Sigma | H3393-25KU | |
| Magnesium Chloride-crystalline | Fisher Scientific | M33-500 | 500 g |
| Maleic Acid | Sigma | M0375-100g | 100g |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
| Molecular-grade Water (RNase-free) | VWR | 7732-18-5 | 500 mL |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3 kg |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| NBT Substrate powder | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 g |
| Normal Goat Serum | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
| Nutating Mixer | VWR | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500g | 500 g |
| PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
| Proteinase K (200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10 mL |
| Plastic Pipettes | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250 mL |
| Shaking Water Bath 12 L | VWR | 10128-126 | 12 L |
| Standard Analog Shaker | VWR | 89032-092 | |
| Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500 g |
| tRNA Yeast | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25 mg |
| Tween 20 | Sigma | P9416-50mL | 50 mL |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
| Lithium Chloride (LiCl) | Sigma-Aldrich | 203637-10G | 10 g |
References
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