Wholemount In Situ Hybridisierung für Astyanax Embryonen
Summary
Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung der Genexpression in embryonalen Astyanax Cavefish. Dieser Ansatz wurde mit dem Ziel der Maximierung der gen-Expression-Signal, bei gleichzeitiger Minimierung der unspezifischen Hintergrundfärbung entwickelt.
Abstract
In den letzten Jahren wurde eine Entwurf Genom für die blinde mexikanischen Cavefish (Astyanax Mexicanus) freigegeben, enthüllt die Sequenz Identitäten für Tausende von Genen. Frühere Forschung in diesem aufstrebenden Modellsystem aktiviert auf umfassende genomweite Untersuchungen, die zahlreiche quantitative Trait Loci (QTL) verbunden mit verschiedenen Höhle verbundenen Phänotypen identifiziert haben. Die Möglichkeit, Gene von Interesse, die erbliche Grundlage für phänotypische Veränderung verbinden bleibt jedoch eine große Herausforderung dar. Eine Technik, die tieferes Verständnis für die Rolle der Entwicklung in der Troglomorphic Evolution erleichtern kann, ist vollständig-hängen in-situ-Hybridisierung. Diese Technik kann implementiert werden, um direkt vergleichen Genexpression zwischen Höhle und Oberfläche Wohnformen, Anwärter Gene zugrunde liegenden etablierten QTL, Gene Interesse von Next Generation Sequencing Studien zu identifizieren oder entwickeln andere Entdeckung-basierte Ansätze. In diesem Bericht stellen wir ein einfaches Protokoll, unterstützt durch eine flexible Checkliste, die für den Einsatz auch außerhalb des Studiensystems der vorgestellten weit angepasst werden kann. Es ist zu hoffen, dass dieses Protokoll für die Astyanax Gemeinschaft und darüber hinaus als eine umfassende Ressource dienen kann.
Introduction
In-situ Hybridisierung ist eine gängige Methode zur Färbung von festen Gewebe um gen-Expression-Muster1zu visualisieren. Diese Technik ist seit Jahren in anderen traditionellen2 und nicht-traditionellen3 -Modellsysteme, für eine Vielzahl von biologischen Studien durchgeführt. Allerdings sind mehrere Schritte und Reagenzien notwendig, um dieses Verfahren erfolgreich durchführen. Für Forscher, die diese Technik noch nie durchgeführt haben, kann es aufgrund der vielen Schritte einschüchternd sein, den Prozess zu initiieren. Weiter, die langwierige Natur dieses Verfahren eignet sich für technische Fehler, die schwierig sein können, um zu beheben.
Das übergeordnete Ziel dieses Artikels ist es, eine einfache und unkomplizierte Methode vorstellen, die diese Hybridisierung-Technik für ein breites Publikum zugänglich machen wird. Um die Einführung von Fehlern zu reduzieren, stellen wir eine einfache Lösung, die liefert hochwertige gen Ausdruck Färbung und unspezifische Hintergrundsignal minimiert. Dieses Verfahren ist ähnlich wie andere Ansätze, die in traditionellen Modellsysteme wie Danio Rerio4entwickelt. Wir wollen hier, sorgfältige Umsetzung der einzelnen Schritte anhand einer herunterladbaren Checkliste (ergänzende Datei 1), sorgfältige Durchführung des Protokolls zu fördern. Die Begründung hierfür ist Organisation durch die vielen Schritte in diesem Verfahren zu erleichtern. Dieser Artikel eignet sich für Forscher interessiert bei der Durchführung von in-situ Hybridisierung vollständig-hängen bei der Entwicklung von Embryonen, aber noch nicht das Verfahren durchgeführt. Der Vorteil des gewählten Ansatzes für Astyanax Forscher ist, dass es getestet wurde und in Cavefish und Oberfläche Fisch verwandelt, wodurch vergleichende Expressionsanalysen bewährt. Die vorgestellte Methode kann durch Forscher in Studien über Astyanax und anderen Systemen verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aufgrund der Anfälligkeit der RNA zu einer Verschlechterung betrifft einer der wichtigsten Schritte im Protokoll die sterile Synthese der RNA-Sonde. Jedoch wenn eine Sonde sorgfältig erzeugt wird und gute Ergebnisse liefert, kann es in folgenden befleckenden Reaktionen wiederverwendet werden. Ein zweiter wichtiger Schritt ist die sorgfältige Herstellung der alle Reagenzien im gesamten Protokoll. Da dieses Protokoll mehrere Tage und viele kleine Schritte umfasst, ist es wichtig, dass alle Reagenzien genau produziert un…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchte Mitglieder des Brutto-Labors für die hilfreichen Kommentare auf diesem Manuskript danken. Wir wollen vier Schülerinnen und Schüler zu würdigen, die dieses Protokoll während Sommerpraktika in 2017 und 2018, darunter Christine Cao, Michael Warden, Aki Li und David Nwankwo genutzt. HL wurde im Sommer 2017 durch ein UC-Biologie-STEM-Stipendium unterstützt. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von der National Science Foundation (DEB-1457630, JBG), National Institute of Dental und Craniofacial Forschung (NIH; DE025033, JBG).
Materials
| 10 mL Serological Pipette | VWR | 89130-888 | |
| 1000 mL Filtration Unit | VWR | 89220-698 | |
| 15 mL Conical | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| 25 mL Serological Pipette | VWR | 89130-890 | |
| 250 mL Filtration Unit | VWR | 89220-694 | |
| 5 mL Serological Pipette | VWR | 89130-886 | |
| 50 mL Conical | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500 mL Filtration Unit | VWR | 89220-696 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 g |
| Blocking Solution | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 g |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
| DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
| Ethanol | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
| Glass dram vials | VWR | 66011-041 | 1 Dr |
| Glass Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
| HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 mL |
| Heparin | Sigma | H3393-25KU | |
| Magnesium Chloride-crystalline | Fisher Scientific | M33-500 | 500 g |
| Maleic Acid | Sigma | M0375-100g | 100g |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
| Molecular-grade Water (RNase-free) | VWR | 7732-18-5 | 500 mL |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3 kg |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| NBT Substrate powder | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 g |
| Normal Goat Serum | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
| Nutating Mixer | VWR | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500g | 500 g |
| PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
| Proteinase K (200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10 mL |
| Plastic Pipettes | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250 mL |
| Shaking Water Bath 12 L | VWR | 10128-126 | 12 L |
| Standard Analog Shaker | VWR | 89032-092 | |
| Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500 g |
| tRNA Yeast | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25 mg |
| Tween 20 | Sigma | P9416-50mL | 50 mL |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
| Lithium Chloride (LiCl) | Sigma-Aldrich | 203637-10G | 10 g |
References
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