In Situ ハイブリダイゼーションアステュアナクス胚の Wholemount
Summary
このプロトコルは、胚のアステュアナクス血脈遺伝子発現可視化を実現。 にします。このアプローチは非特異染色を最小限に抑えながら遺伝子式信号を最大の目標としてきた.
Abstract
近年、たくさんの遺伝子のシーケンスの身元を明かす、盲目のメキシコの血脈 (アステュアナクス メキシコ) のゲノムがリリースされています。この新たなモデル システムに先行研究は、様々 な洞窟を伴う表現型に関連付けられている多数の量的形質遺伝子座 (QTL) を識別した広範囲のゲノム広い調査の資本金。ただし、表現型変化の遺伝の基礎に興味のある遺伝子を接続する能力は重要な課題です。Troglomorphic の進化の役割のより深い理解を容易にすることができます 1 つの方法は、ホール マウント in situ ハイブリダイゼーションです。この手法を実装して、直接洞窟と表面の住居形態の間の遺伝子発現を比較、確立された QTL を根底にある遺伝子の候補者を指名、次世代シーケンシングの研究から興味のある遺伝子を識別または他を開発できます。検出ベースのアプローチ。このレポートで広く研究から開発されたシステムを越えての使用のために合わせることができる柔軟性の高いチェックリストによってサポートされている単純なプロトコルを提案します。このプロトコルのアステュアナクスコミュニティの内外に広範なリソースとして使用できることが望まれます。
Introduction
In situ ハイブリダイゼーションは、遺伝子発現パターン1を視覚化する固定ティッシュの汚損のための一般的な方法です。この手法を他の伝統的な2および非伝統的な3モデル システムでは、さまざまな生物学的研究の年行った。ただし、いくつかの手順と試薬は、この手順を正常に実行する必要です。この手法を実行したことがない者は、プロセスを開始する多くの手順のおかげで威圧的なことができます。さらに、この手順の長い性質は、トラブルシューティングに挑戦することができます技術的なエラーに適しています。
この記事の全体的な目標は、幅広い視聴者にアクセス可能なこの交配の技術を表示するシンプルで簡単な方法を提示することです。エラーの概要を減らすためには、質の高い遺伝子式染色が得られますし、非固有バック グラウンド信号を最小限に抑える簡単な方法を提案する.この手順は、他の動脈分布4などの伝統的なモデル システム開発のアプローチに似ています。ここでは、慎重に慎重に実装されたプロトコルを促進するためにダウンロード可能なチェックリスト (補足ファイル 1) を使用して各ステップの実装を容易にするために目指しています。これを行うための理論的根拠は、この手順に関与する多くのステップを介して組織を促進することです。この記事が、初期胚ホール マウント in situ ハイブリダイゼーションを行うに興味がある研究者の適切な手順をまだ実行していません。アステュアナクス研究者の選択した方法の利点はことそれが試され、血脈の表層魚群モーフ、これにより比較表現の分析を促進します。アステュアナクスおよび他のシステムの研究で研究者によって提示されたメソッドを使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
劣化する RNA の脆弱性によりプロトコルの最も重要な手順の 1 つは RNA プローブの滅菌の合成にかかわる。ただし、プローブが生成されます慎重に良い結果を提供し場合、は、その後染色反応では使用できます。2 番目の重要なステップは、プロトコルで使用されるすべての試薬の慎重な生産です。このプロトコルには、数日、多くの小さなステップが含まれているのでそれが必要し、滅菌方?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この原稿の有用なコメントのための総研究室のメンバーを感謝致します。2017、2018、クリスティン曹、マイケル ・ ウォーデン、安芸李デビッド ヌワンコなど夏のインターンシップ中にこのプロトコルを利用する 4 つの高校生を認識したいです。HL は 2017 年の夏カリフォルニア大学生物学幹交わりによって支えられました。この作品は全米科学財団 (デブ 1457630 JBG に)、国立機関歯科・頭蓋顔面研究所 (NIH; からの補助金によって支えられました。JBG に DE025033)。
Materials
| 10 mL Serological Pipette | VWR | 89130-888 | |
| 1000 mL Filtration Unit | VWR | 89220-698 | |
| 15 mL Conical | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| 25 mL Serological Pipette | VWR | 89130-890 | |
| 250 mL Filtration Unit | VWR | 89220-694 | |
| 5 mL Serological Pipette | VWR | 89130-886 | |
| 50 mL Conical | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500 mL Filtration Unit | VWR | 89220-696 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 g |
| Blocking Solution | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 g |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
| DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
| Ethanol | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
| Glass dram vials | VWR | 66011-041 | 1 Dr |
| Glass Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
| HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 mL |
| Heparin | Sigma | H3393-25KU | |
| Magnesium Chloride-crystalline | Fisher Scientific | M33-500 | 500 g |
| Maleic Acid | Sigma | M0375-100g | 100g |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
| Molecular-grade Water (RNase-free) | VWR | 7732-18-5 | 500 mL |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3 kg |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| NBT Substrate powder | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 g |
| Normal Goat Serum | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
| Nutating Mixer | VWR | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500g | 500 g |
| PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
| Proteinase K (200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10 mL |
| Plastic Pipettes | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250 mL |
| Shaking Water Bath 12 L | VWR | 10128-126 | 12 L |
| Standard Analog Shaker | VWR | 89032-092 | |
| Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500 g |
| tRNA Yeast | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25 mg |
| Tween 20 | Sigma | P9416-50mL | 50 mL |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
| Lithium Chloride (LiCl) | Sigma-Aldrich | 203637-10G | 10 g |
References
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