Wholemount In Situ hybridisatie voor Astyanax embryo 's
Summary
Visualisatie van de expressie van genen in embryonale Astyanax cavefish kunnen dit protocol. Deze aanpak is ontwikkeld met als doel het maximaliseren van gen expressie signaal, terwijl het minimaliseren van aspecifieke achtergrondkleuring.
Abstract
In de afgelopen jaren heeft het genoom van een ontwerp voor de blinde Mexicaanse cavefish (Astyanax mexicanus) vrijgegeven, onthullen de identiteit van de reeks voor duizenden genen. Voorafgaande onderzoek naar deze opkomende modelsysteem gekapitaliseerd op uitgebreide genoom-brede onderzoeken, die talrijke kwantitatieve trait loci (QTL) die is gekoppeld aan verschillende grot-geassocieerde fenotypen hebben geïdentificeerd. De mogelijkheid om de erfelijke basis voor verandering van de fenotypische verbinden met de genen van belang blijft echter een aanzienlijke uitdaging. Een techniek die dieper begrip van de rol van ontwikkeling in de evolutie van de troglomorphic vergemakkelijken kan is geheel-mount kruising in situ. Deze techniek kan worden toegepast om rechtstreeks vergelijken van genexpressie tussen grot – en oppervlakte-woning vormen, kandidaat benoemen genen onderliggende gevestigde QTL, identificeren van genen van belang van volgende-generatie sequencing studies of ontwikkelen van andere ontdekking-gebaseerde benaderingen. In dit verslag stellen we een eenvoudig protocol, ondersteund door een flexibele controlelijst, die wijd aangepast voor gebruik goed buiten het gepresenteerde studie-systeem worden kan. Gehoopt wordt dat dit protocol als een grote bron voor de Astyanax -Gemeenschap en daarbuiten dienen kan.
Introduction
Kruising in situ is een gemeenschappelijke methode voor de kleuring van vaste weefsels om te visualiseren van gen expressie patronen1. Deze techniek heeft jarenlang in andere traditionele2 – en niet-traditionele3 modelsystemen, voor een verscheidenheid van biologische studies verricht. Er zijn echter verschillende stappen en reagentia moet deze procedure uitvoeren. Voor onderzoekers die deze techniek nog nooit hebt uitgevoerd, kan starten van het proces worden intimiderende als gevolg van de vele stappen. Verder, het langdurige karakter van deze procedure leent zich voor technische fouten, die kunnen lastig zijn om op te lossen.
Het algemene doel van dit artikel is om een eenvoudige en ongecompliceerde methode die zal deze kruising techniek voor een breed publiek toegankelijk te maken. Verklein de invoering van fouten en presenteren we een eenvoudige benadering die levert hoge kwaliteit gen expressie kleuring en minimaliseert aspecifieke achtergrond signaal. Deze procedure is vergelijkbaar met andere benaderingen ontwikkeld in traditionele modelsystemen, zoals Danio rerio4. Hier, streven wij naar het vergemakkelijken van zorgvuldige uitvoering van elke stap met behulp van een downloadbare checklist (aanvullende bestand 1), zorgvuldige uitvoering van het protocol te bevorderen. De reden hiervoor is het vergemakkelijken van de organisatie door middel van de vele stappen die betrokken zijn bij deze procedure. Dit artikel is geschikt voor onderzoekers ook geïnteresseerd in het uitvoeren van geheel-mount kruising in situ in het ontwikkelen van embryo’s, maar de procedure nog niet hebben uitgevoerd. Het voordeel van de gekozen aanpak voor Astyanax onderzoekers is dat het is getest en in zowel cavefish en oppervlakte vissen morphs bewezen, teneinde vergelijkende expressie analyses. De onderhavige methode kan worden gebruikt door onderzoekers in studies over Astyanax en andere systemen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vanwege de kwetsbaarheid van RNA voor afbraak betreft een van de belangrijkste stappen in het protocol de steriele synthese van de RNA-sonde. Echter, als een sonde zorgvuldig wordt gegenereerd, met goede resultaten, kan het worden hergebruikt in latere kleuring reacties. Een tweede cruciale stap is de zorgvuldige productie van alle reagentia in het gehele protocol gebruikt. Aangezien dit protocol betrekking heeft op verschillende dagen en veel kleine stapjes, is het essentieel dat alle reagentia nauwkeurig worden geprodu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank leden van de bruto lab voor nuttige opmerkingen op dit manuscript. Wij willen vier middelbare schoolstudenten die dit protocol tijdens de zomer stages in 2017 en 2018 gebruikt, met inbegrip van Christine Cao, Michael Warden, Aki Li en David Nwankwo erkennen. HL werd gesteund door een UC biologie stam Fellowship in de zomer van 2017. Dit werk werd gesteund door subsidies van de National Science Foundation (DEB-1457630 aan de JBG), en de nationale instituten van tand- en craniofaciale onderzoek (NIH; DE025033 aan de JBG).
Materials
| 10 mL Serological Pipette | VWR | 89130-888 | |
| 1000 mL Filtration Unit | VWR | 89220-698 | |
| 15 mL Conical | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| 25 mL Serological Pipette | VWR | 89130-890 | |
| 250 mL Filtration Unit | VWR | 89220-694 | |
| 5 mL Serological Pipette | VWR | 89130-886 | |
| 50 mL Conical | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500 mL Filtration Unit | VWR | 89220-696 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 g |
| Blocking Solution | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 g |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
| DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
| Ethanol | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
| Glass dram vials | VWR | 66011-041 | 1 Dr |
| Glass Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
| HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 mL |
| Heparin | Sigma | H3393-25KU | |
| Magnesium Chloride-crystalline | Fisher Scientific | M33-500 | 500 g |
| Maleic Acid | Sigma | M0375-100g | 100g |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
| Molecular-grade Water (RNase-free) | VWR | 7732-18-5 | 500 mL |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3 kg |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| NBT Substrate powder | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 g |
| Normal Goat Serum | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
| Nutating Mixer | VWR | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500g | 500 g |
| PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
| Proteinase K (200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10 mL |
| Plastic Pipettes | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250 mL |
| Shaking Water Bath 12 L | VWR | 10128-126 | 12 L |
| Standard Analog Shaker | VWR | 89032-092 | |
| Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500 g |
| tRNA Yeast | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25 mg |
| Tween 20 | Sigma | P9416-50mL | 50 mL |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
| Lithium Chloride (LiCl) | Sigma-Aldrich | 203637-10G | 10 g |
References
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. . In situ hybridization: Application to neurobiology. , (1987).
- Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).
- Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression. Evolution & Development. 12 (4), 373-382 (2010).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Cheung, M., Briscoe, J. Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9. Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).
- Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development. Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).
- Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3. Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).
- Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways. Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).
- Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3). Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).
- Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes & Development. 16 (2), 165-170 (2002).
- Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).
- Monsoro-Burq, A. H. A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).
- Schulz, C. In situ hybridization to Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).
