Wholemount Astyanax 배아에 대 한 제자리 교 잡
Summary
이 프로토콜에는 배아 Astyanax cavefish에 유전자 발현의 시각화 수 있습니다. 이 방법은 일반적인 배경 얼룩을 최소화 하면서 진 식 신호를 극대화 하는 목적으로 개발 되었습니다.
Abstract
최근 몇 년 동안에서 맹인 멕시코 cavefish (Astyanax mexicanus)에 대 한 초안 게놈이 나왔다, 유전자의 수천의 시퀀스 id를 공개. 이 신흥 모델 시스템에 대 한 사전 연구는 다양 한 동굴 관련 고기와 관련 된 수많은 양적 특성 loci (QTL) 식별 포괄적인 게놈 넓은 조사에 대문자. 그러나, phenotypic 변화에 대 한 상속 기초에 관심사의 유전자를 연결할 수는 중요 한 도전 남아 있습니다. Troglomorphic 진화에서 개발의 역할의 더 깊은 이해를 촉진 수 있는 하나의 기술은 전체 마운트 제자리 교 잡 이다. 이 기술은 직접 동굴 및 표면 주거 형태 사이의 유전자 발현을 비교, 지명 후보 유전자 설립된 QTL 기본, 다음-세대 시퀀싱 연구에서 유전자 식별 또는 다른 개발을 구현할 수 있다 검색 기반 접근입니다. 이 보고서에서 우리는 널리 제시 연구 시스템을 넘어 잘 사용 하기 위해 적용할 수 있는 유연한 검사 목록에서 지 원하는 간단한 프로토콜을 제시. 그것은 기대 Astyanax 지역 사회를 넘어이 프로토콜 광범위 한 자원으로 사용할 수 있습니다.
Introduction
제자리 교 잡 착 고정된 조직 유전자 표현 패턴1을 시각화 하는 일반적인 방법입니다. 이 기술은 다양 한 생물 학적 연구에 대 한 다른 전통적인2 및 비 전통적인3 모델 시스템에서 년간 수행 되었습니다. 그러나, 여러 단계 및 시 약은이 절차를 성공적으로 수행 하는 데 필요한. 결코이 방법을 수행한 조사 과정을 시작 될 수 있습니다 많은 단계 때문에 협박. 또한,이 절차의 긴 자연에 빌려준다 기술적인 오류를 해결 하기 어려울 수 있습니다.
이 글의 전반적인 목표는이 교 잡 기술은 다양 한 연령층에 접근할 수 렌더링 하는 간단 하 고 간단한 방법을 제시. 오류에 대 한 소개를 줄이기 위해, 선물이 고품질 유전자 식 얼룩 및 일반적인 배경 신호를 최소화 하는 간단한 접근. 이 절차는 다른 접근 Danio rerio4와 같은 전통적인 모델 시스템에서 개발 유사 합니다. 여기, 우리는 프로토콜의 주의 구현할 다운로드 점검 (보충 파일 1)를 사용 하 여 각 단계의 주의 구현 촉진을 목표로 합니다. 이 일에 대 한 근거가이 절차에 관련 된 여러 단계를 통해 조직 촉진 것입니다. 이 문서 전체 마운트 제자리 교 잡 배아 개발 수행에 관심이 있는 연구자에 적합 하지만 아직 절차 수행 하지. Astyanax 연구에 대 한 선택된 방법의 장점은 것 그것이 테스트 되 고 cavefish에 따라서 비교 식 분석을 촉진 하는 표면 물고기 변경해 입증. Astyanax 및 다른 시스템에 대 한 연구에서 연구자에 의해 제시 메서드를 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
저하로 RNA의 취약점 때문 프로토콜의 가장 중요 한 단계 중 하나는 RNA 조사 살 균 합성을 염려 한다. 그러나, 경우는 조사 신중 하 게 생성 되 고 좋은 결과 제공 합니다, 그것은 이후의 착 반응에 활용할 수 있습니다. 두 번째 중요 한 단계는 프로토콜에서 사용 하는 모든 시 약의 주의 생산 이다. 이 프로토콜 포함 하므로 몇 일 및 많은 작은 단계, 그것은 필수적인 모든 시 약은 정확 하 게, 생산과 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자가이 원고에 도움이 의견에 대 한 총 연구소의 회원을 감사 하 고 싶습니다. 4 고 등 학생 들은 여름 인턴쉽 2017, 2018, 크리스틴 카오, 마이클 소장, 아키 리, 데이비드 은완코 등 동안이 프로토콜을 활용 하 길. HL은 UC 생물학 줄기 친목 2017의 여름 동안에 지원 됩니다. 이 작품은 국립 과학 재단 (뎁-1457630 JBG에), 그리고 국립 연구소의 치과 Craniofacial 연구 (NIH;에서 교부 금에 의해 지원 되었다 JBG에 DE025033)입니다.
Materials
| 10 mL Serological Pipette | VWR | 89130-888 | |
| 1000 mL Filtration Unit | VWR | 89220-698 | |
| 15 mL Conical | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| 25 mL Serological Pipette | VWR | 89130-890 | |
| 250 mL Filtration Unit | VWR | 89220-694 | |
| 5 mL Serological Pipette | VWR | 89130-886 | |
| 50 mL Conical | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500 mL Filtration Unit | VWR | 89220-696 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 g |
| Blocking Solution | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 g |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
| DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
| Ethanol | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
| Glass dram vials | VWR | 66011-041 | 1 Dr |
| Glass Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
| HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 mL |
| Heparin | Sigma | H3393-25KU | |
| Magnesium Chloride-crystalline | Fisher Scientific | M33-500 | 500 g |
| Maleic Acid | Sigma | M0375-100g | 100g |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
| Molecular-grade Water (RNase-free) | VWR | 7732-18-5 | 500 mL |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3 kg |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| NBT Substrate powder | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 g |
| Normal Goat Serum | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
| Nutating Mixer | VWR | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500g | 500 g |
| PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
| Proteinase K (200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10 mL |
| Plastic Pipettes | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250 mL |
| Shaking Water Bath 12 L | VWR | 10128-126 | 12 L |
| Standard Analog Shaker | VWR | 89032-092 | |
| Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500 g |
| tRNA Yeast | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25 mg |
| Tween 20 | Sigma | P9416-50mL | 50 mL |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
| Lithium Chloride (LiCl) | Sigma-Aldrich | 203637-10G | 10 g |
References
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. . In situ hybridization: Application to neurobiology. , (1987).
- Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).
- Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression. Evolution & Development. 12 (4), 373-382 (2010).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Cheung, M., Briscoe, J. Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9. Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).
- Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development. Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).
- Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3. Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).
- Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways. Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).
- Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3). Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).
- Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes & Development. 16 (2), 165-170 (2002).
- Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).
- Monsoro-Burq, A. H. A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).
- Schulz, C. In situ hybridization to Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).
