Summary
HeLa 細胞を用いた哺乳類細胞周期中に二本鎖 RNA 結合蛋白質キナーゼ rna (PKR) 勉強 RNA インターアクターのための実験的アプローチを提案します。このメソッドは、クロスリンク RNA PKR 錯体と PKR バインド Rna を豊かにする免疫沈降にホルムアルデヒドを利用しています。これらの Rna は、高スループット シーケンスまたは qRT PCR からさらに分析できます。
Abstract
タンパク質キナーゼ (PKR) rna は生得の免疫反応蛋白質のメンバーであるし、ウイルス Rna の二重鎖の二次構造を認識します。ウイルスの二本鎖 Rna (二本) にバインドされると、PKR は二量体化とそれに続く自己リン酸化を受けます。リン酸化 PKR (pPKR) はアクティブになり、真核生物の開始因子 2 (神経: Eif2) グローバル翻訳を抑制する α サブユニットのリン酸化を誘導します。増加する証拠を PKR を細胞周期の間に生理学的な条件の下で、または感染せず様々 なストレス条件下で起動できるかを示唆しています。しかし、pkr からの RNA の活性剤の私達の理解はキャプチャし、二本の pkr から相互作用を分析する標準化された実験方法の不足のために限られました。ここでは、提案する実験的具体的に豊かにし、PKR を分析するためのプロトコルは HeLa 細胞を用いた細胞周期中に Rna をバインドします。我々 は、PKR RNA 複合体を修正し、免疫沈降で分離するホルムアルデヒドの効率的な架橋アクティビティを利用します。PKR co 沈澱 Rna は、高スループット シーケンス ライブラリを生成するさらに処理することができます。PKR と相互作用する細胞二本鎖 rna の 1 つの主要なクラスは、重鎖と光鎖 Rna の相補的な相互作用による分子鎖 Rna として存在できますミトコンドリア Rna (mtRNAs) です。これらの二重 mtRNAs の strandedness を勉強するには、本鎖固有 qRT PCR のためのプロトコル。私達のプロトコルは PKR バインド Rna の解析に最適化されますが、細胞二本や他の dsRNA の結合蛋白質の RNA インターアクターを研究する簡単に変更できます。
Introduction
プロテインキナーゼ rna (PKR)、として知られている真核生物の開始因子 2 α キナーゼ 2 (EIF2AK2) はよ特徴付けられた蛋白質キナーゼ Rna によって提供される情報を伝送します。それは真核生物の翻訳開始 2 サブユニット α (神経: Eif2) に属するキナーゼ家族とグローバル翻訳1を抑制して感染への応答でセリン 51 で神経: Eif2 を廃止します。このコンテキスト PKR は PKR 活性化と自己リン酸化2のプラットフォームを提供するウイルスの二本鎖 Rna (二本) によってアクティブ化されます。神経: Eif2、に加えて PKR できますもをリン酸化 p53、インスリン受容体基質 1、阻害剤 B、c 6 月 N 末端キナーゼ (JNK) 多数信号伝達経路3,4、5の活動を規制するには 6。
PKR はもともとポリオ ウイルスの伝染の間にポリオ ウイルスの二本7、8を認識することによって神経: Eif2 をリン酸化するキナーゼとして同定されました。PKR は昨今は免疫応答を超えて多面的な役割を果たすことと多くの人間の病気でその異常活性化や故障はございません。アクティブ/Phosphorylated PKR (pPKR) はアポトーシス中によく見られる、変性疾患、特にハンチントン病などの神経変性疾患、パーキンソンのおよびアルツハイマー病9 患者の共通の特徴 ,,1011,12,13。また、PKR は代謝ストレスや熱衝撃14,15,16,17など様々 なストレス条件下で作動します。その一方で、PKR 阻害は高められた細胞増殖とも悪性転化18,19の結果します。PKR 関数はまた正常な脳機能に重要なと pPKR のレベルとして細胞周期の間に高架 M 相20,21,22時。このコンテキストで pPKR はグローバルな翻訳を抑制する適切な細胞分裂20に必要なキーの分裂シグナル伝達システムへの手がかりを提供しています。また、pkr からの持続性の活性化は中国のハムスターの卵巣の細胞周期の停止細胞23G2/m 期で起因しました。その結果、PKR のリン酸化は、21M/G1 遷移中に急速な不活性化を確保するため負帰還ループによって調整されます。
PKR の広い範囲の機能にもかかわらず PKR 活性化の私達の理解は、キャプチャし、PKR をアクティブにすることができます二本を識別する標準化されたハイスループット実験的アプローチの不足のため制限されています。前の研究は、PKR を二本 2 倒立 Alu 反復 (IRAlus)20,24が、細胞周期の間にまたはの下で PKR をアクティブにすることができます追加の細胞二本鎖 rna の存在の可能性によって形成されるやり取りできること示されています。ひと細胞におけるストレス条件は探検でした。RNA 結合タンパク質 (RBP) の RNA インターアクターを識別するに従来のアプローチは、クロスリンク RNA RBP 錯体25,26,27に紫外光を使用します。最近の研究はマウス システムのこの UV 架橋アプローチを適用し、核小体低分子 Rna が代謝ストレス16の間に PKR 活性化を調節することが識別されます。ホルムアルデヒドの高架橋効率を活用することにより28HeLa 細胞の細胞周期中に PKR と相互作用する Rna を識別する方法を提案します。同様のアプローチは、シュタウフェン Drosha29,30,31など他の dsRBPs を研究に適用されています。短い散在させていて核要素 (正弦波)、長い散在核要素 (ライン)、内在性レトロ ウイルス要素 (ERV) とも α サテライト Rna など PKR が非翻訳 Rna のさまざまな種類と対話できるとわかった。また、PKR がミトコンドリア Rna (mtRNAs)、重鎖と光の相補的な相互作用を介してどのフォームの分子間二本鎖 Rna28と対話できることを示した。最近の出版物は、さらにいくつかの mtRNAs が二重のフォームに存在し、dsRNA センサー32インターフェロンを誘発する分化関連タンパク質悪性黒色腫 5 などをアクティブにすることができます私たちのデータをサポートしました。もっと重要なは、表現と mtRNAs の細胞内局変調細胞周期の間に、様々 なストレスによって28PKR 活性化を調節する能力に重要な可能性があります。
この記事で提案する架橋結合する最近開発されたホルムアルデヒドと免役沈降法 (fCLIP) のための詳しいプロトコルを取り込み、細胞周期中に PKR と相互作用する Rna を解析するメソッド。チミジンとノコダゾールを用いた細胞周期停止試料を準備する方法を示す.これらの Rna を識別する高スループット シーケンス ライブラリを準備する PKR バインド Rna とメソッドを特定する fCLIP プロセスを提案する.さらに、我々 は qRT PCR を使用して PKR バインド Rna を分析する手順の詳細を描きます。具体的には、mtRNAs の strandedness を分析するアンチセンス逆転写法を紹介します。記述されていたプロトコルは HeLa 細胞の PKR、最適化されますが、細胞周期サンプル、fCLIP、アンチセンス qRT PCR 解析の準備などの重要なステップは、携帯電話の二本を勉強するまたは他の dsRBPs の RNA インターアクターを識別するために簡単に変更できます。
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Protocol
1. ソリューションおよびセルの準備
- ソリューションの準備
- 細胞培養液の 500 ml ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) の牛胎児血清 (FBS) の 50 mL を追加することによって HeLa 細胞培養のためメディアを準備します。
注: 抗生物質は、細胞培養液に追加できますが、我々 は抗生物質を使用しないでください。 - 0.1% パラホルムアルデヒド解散 1 で 4% (w/v) パラホルムアルデヒド x Phosphate-Buffered 生理食塩水 (PBS) ホット プレート上、希は暖房装置を持つ 1x PBS を追加して 0.1% (v/v) パラホルムアルデヒドの 30 mL をすること。
注意: ヒューム フードのすべての手順を実行、パラホルムアルデヒド ソリューションを沸騰しないように注意してください。0.1% 溶液を光から保護し、4 ° C で保存ソリューションを使用して、1 ヶ月以内。
注: 最後の 0.1% (v/v) パラホルムアルデヒド溶液の pH は約 7 をする必要があります。 - FCLIP の換散バッファーの準備: トリス-HCl (pH 7.5) 20 mM 15 mM 0.1% (v/v) トリトン X-100, 10 ミリメートルの EDTA、0.5% (v/v) ノニデット p40 (NP-40)、塩化ナトリウム 0.1% (v/v) ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) とデオキシ コール酸ナトリウム 0.1% (w/v)。40 mL にトリプル蒸留水 (TDW) を追加します。4 ° C でのストア
- FCLIP 洗浄バッファーを準備: トリス-HCl (pH 7.5) 20 mM 150 mM、0.1% (w/v) 0.1% (v/v) SDS、0.1% (v/v) トリトン X-100 0.1% (v/v) NP 40 塩化ナトリウム、10 ミリメートルの EDTA、デオキシ コール酸ナトリウム。TDW を 40 mL に追加します。4 ° C でのストア
- 4 x PK バッファーを準備: 400 mM トリス-HCl (pH 7.5)、200 mM の NaCl、40 ミリメートルの EDTA および 4% (v/v) SDS。TDW を 40 mL に追加します。常温で保存します。
- FCLIP 溶出バッファーを準備: PK バッファー、尿素、21 g、TDW 8.5 mL x 4 の 20 mL。新鮮な準備します。
- RNA 溶出バッファーを準備: 0.3 M NaOAc と 2% (w/v) SDS。常温で保存します。
- RNA のローディングの染料 × 2 の準備: 95% (v/v) ホルムアミド、0.05% (w/v) SDS 5 mM EDTA 0.025% (w/v) キシレンシアノール 0.025% (w/v) ブロモフェノールの青。-20 ° C にてストア
- 1 x TBE バッファーを準備: 0.089 M Tris ホウ酸塩と 0.002 M EDTA。500 mL の TBE バッファーを準備します。
- 細胞培養液の 500 ml ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) の牛胎児血清 (FBS) の 50 mL を追加することによって HeLa 細胞培養のためメディアを準備します。
- S または M 相逮捕細胞の調製
- 種子の 750,000 ~ または ~ 1,000,000 hela 細胞はそれぞれ S または M 相逮捕サンプルの細胞します。24 h の CO2を 37 ° C、5% で細胞を成長します。
- 2 mM チミジンで細胞を治療し、37 ° C で 18 h インキュベート
- PBS で 2 回細胞を洗浄します。新鮮なメディアを追加し、37 ° C で 9 時間インキュベート
- S 相逮捕細胞、2 mM チミジンとセルを扱います。M 相逮捕細胞 100 ng/mL ノコダゾールとセルを扱います。37 ° C と収穫の細胞で 15 時間孵化させなさい。
注: 細胞周期サンプルの均質性は、FACS を使用して確認できます。
2. ホルムアルデヒド架橋と免役沈降法
- セル収穫
- S の段階のサンプルでは、15 mL の円錐管に細胞スクレーパーと転送細胞を収集します。M 相サンプル、M 相逮捕細胞をデタッチし、15 mL の円錐管にそれらを転送する細胞培養皿の側面をタップします。
注: M 相逮捕細胞の均一性を高めるため細胞スクレーパーを使用しないでください。 - 3 分削除のため室温で 380 x gで細胞上清を遠心し、再 1 ml の PBS 寒くて 1.5 mL 遠心チューブに転送の中断します。
- 遠心 10,000 x gで 4 ° C でセル 30 s. 削除の上清完全に。
- S の段階のサンプルでは、15 mL の円錐管に細胞スクレーパーと転送細胞を収集します。M 相サンプル、M 相逮捕細胞をデタッチし、15 mL の円錐管にそれらを転送する細胞培養皿の側面をタップします。
- 架橋結合するホルムアルデヒド
- セルを修正するために室温で 10 分間 0.1% パラホルムアルデヒドの 750 μ L を追加します。
- 1 M のグリシンの 250 μ L を追加し、反応を抑制するために室温でさらに 10 分間インキュベートします。遠心 10,000 x gで 4 ° C でセル 30 s. 削除の上清完全に。
- 1 mL の PBS を再停止できます。遠心分離機の 10,000 のセル 30 s や削除、上清のための 4 ° C でg x。
- 0.2% (v/v) プロテアーゼ阻害剤と 2% (v/v) RNase 阻害剤を添加した fCLIP 換散バッファーの 400 μ L を再停止できます。氷上で 10 分間インキュベートし、ultrasonicator を用いた超音波照射します。
- ~ 150 mm の NaCl 濃度を調整する 5 M の NaCl の 11 μ L を追加します。簡単に渦と 21,130 x gで 4 ° C で 15 分間遠心上清を中古冷蔵 1.5 mL 遠心チューブに転送します。
注: は、入力サンプルとして新しい遠心管の上澄みの 40 μ L を保持します。4 ° C で入力のサンプルを保存します。
- 免疫沈降
- 1.5 mL 遠心チューブにプロテイン A ビーズの 20 μ L を追加します。
- 400 μ fCLIP 換散バッファーのビードを洗います。4 ° c で 1 分間削除 1,000 x gでビーズの上澄みを遠心し、慎重に fCLIP 換散バッファーの 400 μ L を追加します。優しく再反転 3 でビーズを中断 ~ 4 回。
- 洗浄ステップを 3 回繰り返します。最終的な洗浄の後、上清を完全に取り外します。
- 再 fCLIP 換散バッファーの 300 μ L でビーズを中断します。~ 150 mm の NaCl 濃度を調整する 5 M の NaCl の 8.3 μ L を追加します。PKR 抗体の 10 μ L を追加し、4 ° C でローテーター上 3 時間インキュベート
- 4 ° c で 1 分間削除 1,000 x gでビーズの上澄みを遠心し、fCLIP 洗浄バッファーの 400 μ L を追加します。優しく再反転 3 でビーズを中断 ~ 4 回。
- 洗浄ステップを 2 回繰り返します。最終的な洗浄の後、上清を完全に取り外します。
注: は、渦のミキサーを使用しないでください。手で軽くチューブを反転します。 - ライセート 300 μ L を追加し、回転の 4 ° C で 3 時間インキュベートします。
注: 長いインキュベーション時間増加の背景バインド可能性があります。 - 4 ° c で 1 分間削除 1,000 x gでビーズの上澄みを遠心し、fCLIP 洗浄バッファーの 400 μ L を追加します。優しく再反転 3 でビーズを中断 ~ 4 回。
- 洗浄ステップを 3 回繰り返します。最終的な洗浄の後、上清を完全に取り外します。
- FCLIP 溶出バッファーの 300 μ L を追加します。ビーズから PKR を溶出する 25 の ° C で 3 時間 thermomixer で孵化させなさい。
注: fCLIP 溶出バッファー フレッシュを準備します。 - 常温 1,000 × gで遠心し、上清をきれいなシリコーン チューブに転送します。
注: 微量遠心チューブも ok、ですが、デ架橋ステップ (ステップ 2.3.12) 中に蒸発を防ぐためにシリコーン チューブを優先します。 - プロティナーゼ K の 300 μ L (20 mg/mL) を追加し、65 ° C で一晩インキュベート
注: 温水カバー蒸発を避けるために、thermomixer を使用します。
- RNA の抽出
- 1 h の 37 ° C で 30 s. 加温の酸フェノール クロロホルムおよび渦の 580 μ L を追加します。
- 渦 30 s と常温 12,000 × gで 10 分間遠心します。
- きれいな 1.5 mL 遠心チューブに最上位のレイヤーを転送します。3 M NaOAc、クロム (例えば、Glycoblue) の 0.5 μ L と等量のイソプロパノールの 1/10 量を追加します。-20 ° C で一晩インキュベートします。
- ペレットの 1 h の 4 ° C で最大速度で遠心分離による沈殿物します。
注: RNA/DNA ペレットが認められない場合は、RNA ・ DNA ペレットが観察されるまでクロムと追加 1 h 続行このステップの遠心分離機の追加 0.5 μ を追加します。 - 上澄みを除去し、75% エタノール 1 mL を加えます。4 ° C、12,000 × gで 5 分間遠心は洗浄ステップをあと 1 回繰り返します。清を完全に除去し、室温でペレットを乾燥します。
- 1 h の 37 ° C で 42 μ TDW、DNase 私はバッファリングの 5 μ L、RNase 阻害剤の 1 μ L、DNase I. 孵化の 2 μ L を追加します。
- TDW の 150 μ L、200 μ L 酸フェノール クロロホルムを追加します。常温 12,000 × gで 10 分間 30 s. 遠心の渦。
- きれいな 1.5 mL 遠心チューブに最上位のレイヤーを転送します。3 M NaOAc、クロム、0.5 μ と 100% エチルアルコールの 1 mL の 20 μ L を追加します。-80 ° C で一晩インキュベートします。
- ペレットを沈殿させる、2.4.4 に 2.4.5 の手順で説明するよう 75% エチルアルコールを洗ってください。
- 再 TDW の適切な量を中断します。
3. シーケンス ライブラリの準備
- rRNA 除去
- 再手順 2.4.10 を TDW 28 μ から RNA ペレットを中断します。
注: 最大総 RNA 量未満 5 μ g をする必要があります。 - RRNA を削除する rRNA 除去キットのリファレンス ・ ガイドによって提供される手順に従います。
- RRNA をクリーンアップ磁気ビーズの 160 μ L の追加によって Rna を枯渇しました。
- 〜 15 回のピペッティングして混合し、15 分間室温でインキュベートします。
- 磁気バーにチューブを接続し、上清を除去します。
- 80% エチルアルコールの 300 μ L を付加し、ビーズ、磁気バーにまだ接続されている間インキュベートする 30 秒。
- 新鮮な 300 μ L ソリューションでエチルアルコールを置き換えます。空気は乾燥室温で 12 分間磁気バーのビーズです。
- 再 TDW とミックスの 12 μ L で 15 回のピペッティングでビーズを中断します。
- 磁気バーのビーズを添付し、きれいな PCR チューブに上清を移動します。
- 断片化されたリボソーム Rna (Rrna) の枯渇はキット rRNA によって提供される手順を使い果たします。
- 磁性ビーズおよび繰り返し手順 3.1.3.1 に 3.1.3.6 110 μ L の追加によって Rna をクリーンアップします。
- 再手順 2.4.10 を TDW 28 μ から RNA ペレットを中断します。
- RNA のラベリングとアダプターの結紮
- RRNA 枯渇 Rna 上 10 x CIAP バッファーの 2 μ L、RNase 阻害剤の 1 μ L と南極のアルカリホスファターゼの 2 μ L を追加します。1 h の 37 ° C で、その後、脱燐酸化酵素を不活化する 5 分の 65 ° C を孵化させなさい。
- 10 x PNK バッファーの 3 μ L、RNase 阻害剤 1.5 μ L、1.5 μ T4 PNK 酵素、r-ATP の 0.8 μ L と 1.7 μ TDW を追加します。50 分の 37 ° C で孵化させなさい。
- 10 mM ATP の 1.5 μ L を追加し、さらに 40 分の 37 ° C で孵化させなさい。
- RNA 溶出バッファーの 170 μ L の追加によって反作用を停止します。
- 常温 12,000 × gで 10 分間 30 s. 遠心の酸フェノール クロロホルムおよび渦の 200 μ L を追加します。
- きれいな 1.5 mL 遠心チューブに最上位のレイヤーを転送します。3 M NaOAc、クロム、0.5 μ と 100% エチルアルコールの 1 mL の 20 μ L を追加します。-80 ° C で一晩インキュベートします。
- RNA のペレットを沈殿させる、2.4.4 に 2.4.5 の手順で説明するよう 75% エチルアルコールを洗ってください。再 TDW の 4.5 μ L で中断および RNA 読み込み染料 × 2 の 9 μ L を追加します。
- 95 ° C、5 分および 10% 尿素ページのゲルにロードでサンプルを加熱します。
- 40 分間 370 V でゲルを実行します。
注: は、事前サンプルをロードする前に 90 分の 370 V でゲルを実行します。 - 〜 100-500 塩基領域でゲルをカットして、ゲルを破る。
- 0.3 M の NaCl の 700 μ L を追加し、4 ° C で回転で一晩インキュベートします。
- 列と室温での最高速度で 5 分間遠心するソリューションに転送します。
- きれいな 1.5 mL 遠心チューブに溶出液を転送します。3 M NaOAc、クロム、0.5 μ と等量のイソプロパノールの 1/10 量を追加します。-20 ° C で一晩インキュベートします。
- 3' アダプター結紮
- RNA のペレットを沈殿させる、2.4.4 に 2.4.5 の手順で説明するよう 75% エチルアルコールを洗ってください。
- 再 TDW の 6.5 μ L の RNA ペレットを中断し、1 μ 10 μ M 3' アダプターを追加します。
- PCR チューブに溶液を移および 2 分の 70 ° C で孵化させなさい。
- 10 x 結紮バッファーの 1 μ L、RNase 阻害剤 0.5 μ L および T4 RNA リガーゼ 2 の 1 μ L を追加します。1 h、6 h、25 ° C そして 22 ° C、6 h 28 ° C の孵化させなさい。
- 95 ° C、5 分で 12 μ L の RNA ローディングの染料と熱 × 2 を追加します。
- ゲルの浄化 3' 3.2.9 へ 3.2.13 で説明するように、アダプターが Rna を結紮します。
- 5' アダプター結紮
- RNA のペレットを沈殿させる、2.4.4 に 2.4.5 の手順で説明するよう 75% エチルアルコールを洗ってください。
- 再 TDW の 4.2 μ L の RNA ペレットを中断し、5 μ M 5' アダプターの 1 μ L を追加します。
- PCR チューブに溶液を移および 2 分の 70 ° C で孵化させなさい。
- 10 x リガーゼ バッファー、RNase 阻害剤, 0.8 μ 10 mM ATP、T4 RNA リガーゼ 1 0.8 μ の 0.4 μ L の 0.8 μ L を追加します。1 h、6 h、25 ° C そして 22 ° C、6 h 28 ° C の孵化させなさい。
- 逆のトランスクリプションおよび PCR の拡大
- 5' アダプター結紮 Rna は 4 μ M の逆のトランスクリプションのプライマーの 1 μ L を追加します。2 分の 70 の ° C で、すぐに 4 ° C に冷却
- 5 x FS バッファーの 4 μ L、2.5 mM dNTP の 4 μ L、0.1 M の DTT、RNase 阻害剤の 1 μ L と逆転写酵素の 1 μ L の 1 μ L を追加します。50 ° c 1 時間、70 ° C、15 分間インキュベートします。
- PCR の拡大を準備します。
- RT 製品のミックス 1 μ、25 μ M RPI プライマーの 1 μ L、25 μ M RP1 プライマーの 1 μ L、HF バッファー、2.5 mM dNTP の 4 μ L、インスタレーション、32.5 μ x 5 の 10 μ L、忠実度の高いポリメラーゼの 0.5 μ L。
- 11 の PCR プログラムを実行 〜 13 サイクル。
注意: PCR のためのプログラムは: 98 ° C、30 秒ホット スタート、10 98 ° C で s、60 ° C、30 s と 45 のための 72 ° C s 増幅、および 5 分の 72 ° C。11-13 サイクルに拡大のステップを繰り返します。
- 磁気ビーズと次の手順 3.1.3.1 に 3.1.3.6 40 μ L を使用が、DNA を溶出する TDW の 10 μ L の PCR の製品をクリーンアップします。
- 10 x DNA ローディングの染料の 2 μ L を追加します。6% アクリルアミドのゲルにサンプルをロードし、30 分間 200 V で実行します。
- 室温で 5 分間 Sybr ゴールド (0.01% (v/v) 1 x TBE バッファー) で染色します。
- 室温で 5 分間 1 x TBE バッファーの染色解除。
- ~ 200-700 塩基領域でゲルをカットして、ゲルを破る。
- 0.3 M の NaCl の 700 μ L を追加し、DNA を溶出する室温で一晩インキュベートします。
- すべてのロードに列と室温での最高速度で 5 分間遠心します。
- きれいな 1.5 mL 遠心チューブに溶出液を転送します。3 M NaOAc、クロム、0.5 μ と等量のイソプロパノールの 1/10 量を追加します。-20 ° C で一晩インキュベートします。
- DNA ペレットを沈殿させる、2.4.4 に 2.4.5 の手順で説明するよう 75% エチルアルコールを洗ってください。再 TDW の 20 μ l を中断します。
- シーケンサーを使用してサンプルを分析します。
4. qRT PCR を使用して相互作用の pkr からの Rna の解析
- 方法 1: ランダムな hexamer 逆のトランスクリプション
- 再手順 2.4.10 を TDW 8.5 μ から RNA ペレットを中断し、ソリューションを PCR チューブに転送します。
- 100 μ M のランダムな hexamers の 0.5 μ L と 2.5 mM dNTP の組合せの 4 μ L を追加します。
- 熱ソリューション 65 ° c 5 分のため、すぐには、少なくとも 1 分間氷の上孵化させなさい。
- ミックス反応: 5 x SSIV バッファーの 4 μ L、100 mM DTT、RNase 阻害剤の 1 μ L と逆転写酵素 (200 U/μ L) の 1 μ L の 1 μ L。RNA 溶液に反応混合物を追加します。
- 10 分、50 ° C 10 分の 23 ° c 混合物をインキュベートし、80 ° C, 10 分。
- リアルタイム PCR を用いた cDNA を分析します。
注: リアルタイム PCR のためのプログラムは: 95 ° C、3 分ホット スタート、95 ° C、5 s と 60 ° C、10 増幅、および 95 ° C、30 秒 s、65 ° C、30 s、および 95 ° C、30 メルトの s。40 サイクルに拡大のステップを繰り返します。
- 方法 2: 鎖固有の逆のトランスクリプション
- 逆のプライマーのマスター ミックスを調製: CMV プロモーター配列を含む遺伝子特定の逆のトランスクリプション プライマーの同量は続く 〜 20 ヌクレオチド遺伝子特定シーケンスのミックス。
注: 結合されたすべての遺伝子特定 RT プライマー濃度は 4 μ M です。 - 再手順 2.4.10 を TDW 8.5 μ から RNA ペレットを中断し、ソリューションを PCR チューブに転送します。
- 逆のトランスクリプションのプライマーの 4 μ M のマスター ミックスと 2.5 mM dNTP の組合せの 4 μ L の 0.5 μ L を追加します。
- 熱ソリューション 65 ° c 5 分のため、すぐには、少なくとも 1 分間氷の上孵化させなさい。
- 5 x SSIV バッファーの 4 μ L、100 mM DTT、RNase 阻害剤の 1 μ L と逆転写酵素 (200 U/μ L) の 1 μ L の 1 μ L を混合することによって反応液を準備します。RNA プライマー ミックスに反応液を追加します。
- 50 ° C 10 分、10 分の 80 ° C でソリューションを孵化させなさい。
- リアルタイム PCR を用いた cDNA を分析します。
注: リアルタイム PCR のためのプログラムは、方法 1 で説明したものと同じです。
- 逆のプライマーのマスター ミックスを調製: CMV プロモーター配列を含む遺伝子特定の逆のトランスクリプション プライマーの同量は続く 〜 20 ヌクレオチド遺伝子特定シーケンスのミックス。
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Representative Results
HeLa 細胞を細胞周期の S または M の段階で逮捕するプロセスの模式図を図 1に示します。M 相逮捕のサンプルでは、(図 2 a) 顕微鏡の下で円形の形をした細胞を明確に視覚化できます。細胞周期の停止の効率を調べる、FACS (図 2 b) を使用してセルの核の内容を分析できます。D7F7 抗体が immunoprecipitate PKR する優れた性能を示す免疫沈降効率テストの代表的なデータを図 3に示します。この免疫沈降効率の違いは、2 つの異なる PKR 抗体 (図 4) を使用した高スループット シーケンス ライブラリのクラス分布の相違に反映されてが可能性があります。さらに、PKR immunoprecipitate (図 5 a) の総細胞ライセート (図 5 b) 全体のしみの西部分析を使用して D7F7 抗体の特異性を確認します。図 6は前に、と高スループット シーケンス ライブラリ準備中に Rrna の除去後にアイソトープ信号を示します。図 7は、pkr、Rna co 沈澱ではなくウサギ IgG またはディジョージ症候群の染色体領域 8 (DGCR8) と Rna co 沈澱、mtRNAs の充実を示します。図 8では、特定の代表的な鎖が示しています PKR バインド mtRNAs S または M 相での qRT PCR 解析サンプルを逮捕しました。
図 1: 準備細胞周期停止サンプルのスケマティック。(A, B)S (A) または (B) M 相逮捕された HeLa 細胞の準備の概略図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 細胞周期の分析は、サンプルを逮捕。(A) S または M 相逮捕試料のコントラストの画像相します。バーは 250 μ m を示します。(B) FACS 解析サンプルの核の量を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: PKR 抗体の免疫沈降効率テストします。PKR バインド Rna の成功した濃縮は、決定的な免疫沈降効率 D7F7 抗体などの抗体を使用してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: RNA シーケンス ライブラリ別の pkr から抗体を作製クラス分布。FCLIP 異なる pkr から抗体を用いたマップ配列読み取りの別のクラス分布で起因しました。不一致は、免疫沈降効率の違いによる可能性が高いです。この図は、キムら28から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: D7F7 PKR 抗体の特異性。(A, B)PKR 沈澱 (A) の合計 hela 細胞ライセート (B) 全体のしみの西部分析は、D7F7 抗体が PKR の認識における特異性の高いことを示す、PKR のサイズに対応する 1 つだけの強力なバンドを示した。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: アイソトープ信号の PKR co 沈澱 Rna 。R ATP と 5' 端の分類によって (A) PKR co 沈澱 Rna を検出できます。Radioistope 信号に (B) 減少した成功した rRNA の除去に。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: PKR mtRNA 相互作用の検証。MtRNAs の2倍濃縮を示された抗体を用いた Rna co 沈澱にログインします。のみ PKR co 沈澱の RNA のサンプルは、mtRNAs の強力な濃縮を示した。DGCR8 ウサギ IgG 抗体は、ネガティブ コントロールとして使用されました。この図は、キムら28から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: PKR バインド mtRNAs の鎖固有 qRT PCR 解析します。(A, B)アンチセンス逆のトランスクリプションは、pkr S (A) または (B) M 相逮捕細胞の co 沈澱をいた mtRNAs の strandedness を分析に使用されました。この図は、キムら28から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
S または M 相逮捕のサンプルを準備するプロセスを図 1に示します。S 期の細胞を逮捕、逮捕高効率 (図 1 a) を確保する間に 9 h のリリースで 2 回チミジンと細胞を扱ってチミジンの二重ブロック メソッドを使用しました。チミジンと一度セルを扱って M 相の逮捕のため 9 h のリリースに続いて、ブロック prometaphase (図 1 b) 細胞にノコダゾールを適用します。細胞周期のサンプルを準備する 1 つの重要なステップは、最初のチミジン ブロック後リリースのステップです。チミジンを完全に削除するには、少なくとも 2 回新鮮な PBS のセルを洗浄するが重要です。不適切な洗浄および残留チミジン増加の不均質性と減少した細胞で起因できます。M 相逮捕の成功は、円形の細胞 (図 2 a) 数の増加に基づいて視覚的に確認できます。ただし、M 相サンプルはまだ彼らの形態に基づく多くの間期細胞を含まれています。M 相逮捕細胞だけを集めて、表面から M 期の細胞をデタッチするのには物理的な力を適用されます。収穫された細胞の核コンテンツさらに S 期と M 相逮捕サンプル (図 2 b) の 4 n で鋭いピークを 2 n と 4 n のブロードなピークを示した facs を調べた。提案するプロトコルは、HeLa 細胞倍加時間は約 24 時間があるに最適です。二重チミジン チミジン ノコダゾール ブロックのアイデアは、他の細胞に適用できるが、正確な薬物治療とリリース期間が標的細胞の倍加時間を基に最適化が必要があります。
我々 はホルムアルデヒドで架橋 PKR RNA 複合体相互作用の pkr から Rna を識別するために、免疫沈降によってそれらを濃縮します。その後の分析の精度を決定する重要な要素は、免疫沈降の効率です。我々 は、高スループット シーケンス ライブラリの準備のための抗体を決定するために PKR タンパク質の異なるエピトープを対象とする多数の抗体をテストしています。図 3のように、我々 は dsRNA 結合ドメインと PKR を捉えることに優れた能力を示した触媒ドメイン間のリンカー領域を認識する D7F7 抗体を分かった。図 3 (ミリ) に示すように、他の抗体は N-末端領域を認識しますが、immunoprecipitating PKR で貧しい人々 の能力を示しています。その結果、ミリ抗体を用いた高スループット シーケンス ライブラリ含まれ、28 の特定の地域で異なる蓄積せず、イントロンを中心に、ゲノム全体に分散している多くの背景配列読み取り(図 4)。2 つのシーケンス ライブラリの不一致、たいがいは抗体の免疫沈降段階 PKR を取り込む能力の違いと考えています。さらに全体のしみ immunoprecipitate (図 5 a) と合計 hela 細胞溶解液 (図 5 b) の西部の分析を通じて D7F7 PKR 抗体の特異性を調べた。両方のしみだけ PKR に対応する 1 つの強力なバンドを観察しました。これは D7F7 抗体は特異性の高いを示します PKR の真の RNA インターアクターを取得可能性があります D7F7 抗体を用いたシーケンス データに反映します。
高スループット シーケンス ライブラリの準備の間に重要なステップは、Rrna の除去です。以来、私たちはホルムアルデヒドで架橋 RNA RBP の複合体、細胞の完全な換散のため、ultrasonicator を使用しました。このプロセスの結果、rRNA を用いた rRNA 除去の効率を大幅に削減する Rrna の断片化除去キット。この問題を解決するには、rRNA を使用する最初の削除キットに続いて、rRNA 枯渇キット (材料の表を参照) をほぼ完全に除去された Rrna と合計配列の読み取りの 1% 未満は Rrna にマップされました。我々 は順番にこれらの 2 つのキットを使用、rRNA 枯渇はキットの最大容量を持っているだけで、rRNA 中 1 μ g 除去キットの最大容量がありますので 5 μ g。我々 は Rrna にマップ配列読み取りのかなりの量の結果の総 RNA の推奨量より多くを使用して経験しています。R - PNK 反応により ATP の Rna にラベリングした後 rRNA の成功の削除を確認できます。劣化 Rna が 50 に対応する地域全体で約 150 nt、rRNA 除去を強く示しています前にサンプル信号明瞭なバンドを示した、rRNA 中 〜 300 nt (図 6)。
架橋結合するホルムアルデヒドの制限を 1 つ減少免疫沈降効率であります。など免疫細胞化学架橋結合するホルムアルデヒドの他のアプリケーションは通常、固定用 4% パラホルムアルデヒド溶液を使用します。ただし、高いバック グラウンドで結果免疫沈降効率が大きく下がるためこのような強力な固定状態を fCLIP 実験のため適用できません。また、ホルムアルデヒド固定架橋タンパク質複合体蛋白・ RNA 複合体に加えて。したがって、1 つは、fCLIP データの解釈には注意を払う必要があります。
既報のように、mtRNAs は PKR28によって認識される分子間の二本を形成します。最初 qRT PCR を通して PKR mtRNA 相互作用を調べることによって、シーケンス データを検証しました。MtRNAs (図 7) のすべての濃縮を示さなかったネガティブ コントロールとしてウサギ IgG 抗体 DGCR8 を使用しました。注記のうち、DGCR8 は、mtRNAs から物理的に分離された核 dsRNA 結合タンパク質として使用されました。同時に、PKR co 沈澱 Rna mtRNAs (図 7) の強力な濃縮を示した。
PKR mtRNA 相互作用をさらに分析するには、ストランド固有光ストランド mtRNAs (図 8) から重い鎖 mtRNAs を区別するために逆のトランスクリプションを行った。逆のトランスクリプション CMV プロモーター シーケンスを持つプライマー特定遺伝子が続くし、qPCR 分析のため左のプライマーおよび正しい遺伝子特定のプライマーとして CMV プロモーターを使用を考案しました。私達はまた SP6 プロモーターと CMV プロモーターではなく pGEX 配列のプライマー シーケンスをテストしました。CMV プロモーターながら pGEX のプライマー シーケンスのシーケンスを示したこと良い結果 SP6 のプロモーターを使用していないがわかった。違いは、SP6 プロモーター (33%) の GC 含量が低いためCMV プロモーター (~ 67%) に比べてください。pGEX 配列のプライマー (~ 65%)シーケンス。アンチセンス逆のトランスクリプションの提案は他の分子間の二本に簡単に適用できるが、GC コンテンツを考慮する必要があります逆のトランスクリプションのプライマーを設計するとき。
全体的にみて、細胞周期逮捕された試料の調製と架橋結合するホルムアルデヒドと免役沈降法での PKR と相互作用する Rna の濃縮を行った。高効率 D7F7 抗体を使用すると、正常に PKR バインド Rna を分離して生成と高スループット シーケンス ライブラリの分析によってこれらの Rna を識別します。さらに、mtRNAs 行きの pkr からの strandedness を分析する我々 は鎖特異的転写、逆アプローチを紹介しました。他の dsRBPs の RNA インターアクターとセンスとアンチセンス転写産物の相補的な相互作用を介して形成される分子間の二本鎖 rna の strandedness の勉強を提案するプロトコルを簡単に最適化できると見込んでいます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、基本的な科学研究開発プログラムを通じて、国立研究財団の韓国 (NRF) 韓国政府科学省と ICT (NRF 2016R1C1B2009886) によって資金を供給によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| 1 M Tris, pH 7.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1 M Tris, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10% Nonidet-p40 (NP-40) | Biosolution | BN015 | |
| 10X DNA loading buffer | TaKaRa | 9157 | |
| 15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
| 3' adaptor | 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3' | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9740 | |
| 5' adaptor | 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3' | ||
| 5 M NaCl | Thermo Fisher Scientific | AM9760G | |
| 50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
| Acid-phenol chloroform, pH 4.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9722 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads DNA/RNA clean up |
| Antarctic alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0289S | |
| Anti-DGCR8 | Made in house | ||
| Anti-PKR (D7F7) | Cell signaling technology | 12297S | |
| Anti-PKR (Milli) | Millipore EMD | 07-151 | |
| ATP (100 mM) | GE Healthcare | GE27-2056-01 | |
| Bromophenol blue sodium salt | Sigma-aldrich | B5525 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | TaKaRa | 2250A | |
| Cell scraper 25 cm 2-position | Sarstedt | 83.183 | |
| CMV promoter sequence | 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3' | ||
| Dulbecco's modified eagle medium | Welgene | LM001-05 | |
| dNTP mixture (2.5 mM) | TaKaRa | 4030 | |
| Ethanol, Absolute, ACS Grade | Alfa-Aesar | A9951 | |
| Fetal bovine serum | Merck | M-TMS-013-BKR | |
| Formamide | Merck | 104008 | |
| Glycine | Bio-basic | GB0235 | |
| GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | AM9516 | |
| Isopropanol | Merck | 8.18766.1000 | |
| NEBNext rRNA Depletion Kit | New England Biolabs | E6318 | rRNA Depletion Kit |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Normal rabbit IgG | Cell signaling technology | 2729S | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 6148 | |
| PCR forward primer (RP1) | 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3' | ||
| PCR index reverse primer (RPI) | 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3' | ||
| PCR tubes with flat cap, 0.2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| Phosphate bufered saline (PBS) Tablet | TaKaRa | T9181 | |
| Phusion high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | High-fidelity polymerase |
| PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor | Benchmark | c2000 | |
| Polynucleotide kinase (PNK) | TaKaRa | 2021A | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115879001 | |
| qPCR primer sequence: CO1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO1 Light | Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Light | Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Light | Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Heavy | Forward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Light | Forward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: GAPDH | Forward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Light | Forward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Light | Forward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Light | Forward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Light | Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Random hexamer | Thermo Fisher Scientific | SO142 | |
| Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) | TaKaRa | 2270A | |
| Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL) | TaKaRa | 2313A | |
| Ribo-Zero rRNA Removal Kit | Illumina | MRZH116 | rRNA Removal Kit |
| Rotator | FINEPCR, ROTATOR AG | D1.5-32 | |
| RT primer sequence: CO1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′ | ||
| RT primer sequence: GAPDH | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′ | ||
| Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube | Bio Plas | 4167SLS50 | |
| Sodium dedecyl sulfate | Biosesang | S1010 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SUPERase In Rnase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18080093 | Reverse transcriptase for library preparation |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | Reverse transcriptase for qRT-PCR |
| SYBR gold nucleic acid gl stain | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204 | |
| T4 RNA ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373 | |
| Thermomixer | Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop | ||
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T9250 | |
| Tris-borate-EDTA buffer (TBE) | TaKara | T9122 | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| Ultralink Protein A sepharose beads | Thermo Fisher Scientific | 22810 | Protein A beads |
| Ultrasonicator | Bioruptor | ||
| Urea | Bio-basic | UB0148 | |
| Vortex mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM) | PerkinElmer | BLU502A100UC |
References
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