Summary

Het combineren van niet-vermindert SDS-pagina analyse en chemische crosslinking om multimeric complexen te ontdekken die door disulfide verbindingen in zoogdiercellen in cultuur worden gestabiliseerd

Published: May 02, 2019
doi:

Summary

Disulfide verbanden zijn al lang bekend om de structuur van veel eiwitten te stabiliseren. Een eenvoudige methode om multimeric complexen te analyseren die door deze aaneenschakelingen worden gestabiliseerd is door niet-vermindert SDS-pagina analyse. Hier wordt deze methode geïllustreerd door het analyseren van de nucleaire isovorm van dUTPase van het menselijk bot Osteosarcoom Cell line U-2 OS.

Abstract

De structuren van vele proteïnen worden gestabiliseerd door covalente disulfide aaneenschakelingen. In recent werk is deze obligatie ook geclassificeerd als een post-translationele modificatie. Zo is het belangrijk om deze modificatie in levende cellen te kunnen bestuderen. Een eenvoudige methode om deze cysteïne-gestabiliseerde multimeric complexen te analyseren is door een methode in twee stappen van niet-vermindert SDS-pagina analyse en formaldehyde het cross-linking. Deze methode in twee stappen is voordelig als de eerste stap aan het blootleggen multimeric complexen die door disulfide aaneenschakelingen worden gestabiliseerd toe te schrijven aan zijn technisch gemak en lage kosten van verrichting. Hier, de Human Bone Osteosarcoom Cell line U-2 OS wordt gebruikt om deze methode te illustreren door specifiek analyseren van de nucleaire isovorm van dUTPase.

Introduction

Disulfide verbanden zijn al lang bekend om de structuur van veel eiwitten te stabiliseren. In recent werk, deze band is ook geclassificeerd als een omkeerbare post-translationele modificatie, als een cysteïne-gebaseerde “redox switch” waardoor de modulatie van de eiwitfunctie, locatie en interactie1,2, 3,4. Zo is het belangrijk om deze wijziging te kunnen bestuderen. Een eenvoudige methode om deze cysteïne-gestabiliseerde multimeric complexen te analyseren is door niet-vermindert SDS-pagina analyse5. SDS-pagina analyse is een techniek die in vele laboratoria wordt gebruikt, waar de resultaten kunnen worden verkregen en worden geïnterpreteerd snel, gemakkelijk, en met minimale kosten, en is voordelig over andere technieken die worden gebruikt om disulfide aaneenschakelingen zoals massaspectrometrie 6 te identificeren ,7 en circulaire dichroism8.

Een belangrijke stap in het bepalen of deze methode is een geschikte techniek om te helpen bij een studie is om grondig te onderzoeken de primaire sequentie van het eiwit van belang te verzekeren zijn er cysteïne residu (s) aanwezig. Een andere nuttige stap moet om het even welke vorige gepubliceerde kristalstructuren onderzoeken of een bioinformatica toepassing gebruiken om de driedimensionele structuur van de proteïne van belang te onderzoeken om te visualiseren waar het cysteïne residu (s) kan worden gevestigd. Als het residu (s) aanwezig is op de buitenkant kan het een betere kandidaat om een disulfide koppeling in plaats van een cysteïne residu begraven op de binnenkant van de structuur te vormen. Het is echter belangrijk op te merken dat eiwitten structurele veranderingen kunnen ondergaan op substraat interacties of eiwit-Eiwitinteracties waardoor deze residuen vervolgens worden blootgesteld aan het milieu ook.

Geïdentificeerde multimeric complexen kan vervolgens worden geverifieerd met chemische cross-linking met behulp van formaldehyde. Formaldehyde is een ideale cross-linker voor deze verificatie techniek als gevolg van de hoge cel permeabiliteit en korte cross-linking span van ~ 2-3 Å, zorgen voor de opsporing van specifieke eiwit-Eiwitinteracties9,10. Hier wordt deze methode geïllustreerd door het analyseren van de nucleaire isovorm van dUTPase van het menselijk bot Osteosarcoom Cell line U-2 OS11. Dit protocol kan echter worden aangepast voor andere cel lijnen, weefsels en organismen.

Protocol

1. het blokkeren van vrije cysteïne residuen gebruikend Iodoacetamide Grow U-2 OS cellen in een 6 cm2 schotel tot 50%-60% confluency in minimale essentiële medium met een hoge glucose met 10% foetale boviene serum en 1% natrium pyruvaat bij 37 ° c in 5% Co2. Maak een verse voorraad van 10 mM iodoacetamide net voor gebruik, dan gooi alle ongebruikte reagens. Voeg 0,1 mM definitieve concentratie iodoacetamide rechtstreeks aan de cel cultuurmedia. Zachtjes Rock de scho…

Representative Results

Nucleaire dUTPase vormt een intermoleculaire disulfide koppeling vormen een stabiele dimeer configuratie door de interactie van twee cysteïne residuen gepositioneerd op het derde aminozuur van elk monomeer eiwit11. Dit wordt aangetoond in Figuur 1a, B. Om ervoor te zorgen dat deze disulfide koppeling was niet een niet-specifieke interactie als gevolg van migratie afwijkingen in de niet-verminderde omgeving, t de opnem…

Discussion

De hier geschetste methode geeft een rechttoe rechtaan protocol voor de analyse van multimeric complexen gestabiliseerd door disulfide verbanden. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan andere cellen cultuurlijnen, weefsels en organismen waardoor een breed scala van toepassingen.

Een belangrijke stap in deze procedure is ervoor te zorgen dat de disulfide verbanden geen gevolg zijn van de extractie procedure. Elke vrije cysteïne residuen kunnen worden geblokkeerd met behulp van iodoa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij waarderen de inspanningen naar voren gebracht door Dr Jennifer Fischer voor de reiniging van de dUTPase polyclonal antilichaam en Kerri Ciccaglione voor al haar inspanningen om te helpen dit manuscript te bewerken. Dit onderzoek werd deels ondersteund door een subsidie van de New Jersey Health Foundation (Grant #PC 11-18).

Materials

16% precast TGX gels ThermoFisher Xp00160
175 cm2 Flask Cell star 658175
18CO ATCC CRL-1459
6 cm2 dish VWR 10861-588
A549 ATCC CCL-185
Amersham ECL detection kit GE 16817200
Blot transfer apparatus Biorad 153BR76789
BME Sigma Aldrich M3148
Bradford protein reagent Biorad 5000006
Bromophenol Blue
BSA Cell signaling 99985
Cell lysis buffer Cell signaling 9803
Centrifuge Eppendor 5415D
DMEM Gibco 11330-032
Drill
EDTA Sigma Aldrich M101
Electrophoresis apparatus Invitrogen A25977
Extra thick western blotting paper ThermoFisher 88610
Fetal bovine serum Gibco 1932693
Formaldehyde ThermoFisher 28908
Glass-teflon homogenizer
Glycerol Sigma Aldrich 65516
Glycine RPI 636050
Heat block Denville 10285-D
Hepes Sigma Aldrich H0527
Hydrochloric acid VWR 2018010431
Iodoacetamide ThermoFisher 90034
Kimwipe Kimtech 34155
Methanol Pharmco 339000000
Non-fat dry milk Cell signaling 99995
PBS Sigma Aldrich P3813
PMSF Sigma Aldrich 329-98-6
Posi-click tube Denville C2170
Power supply Biorad 200120
Prestained marker ThermoFisher 26619
PVDF membrane Biorad 162-0177
Rocker Reliable Scientific 55
Saos2 ATCC HTB-85
SDS Biorad 161-0302
Secondary antibody Cell signaling 70748
Small cell scraper Tygon S-50HL class VI
Sodium chloride RPI S23020
Sodium pyruvate Gibco
Sonicator Branson 450
Sponge pad for blotting Invitrogen E19051
Stir plate Corning PC353
Sucrose Sigma Aldrich S-1888
Tris Base RPI T60040
Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5 Sigma Aldrich SRE0031
Tris-Glycine running buffer VWR J61006
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787
Tween 20 Sigma Aldrich P9416
U-2 OS ATCC HTB-96
X-ray film ThermoFisher 34090

References

  1. Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. Cysteine-based redox switches in enzymes. Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).
  2. Antelmann, H., Helmann, J. D. Thiol-based redox switches and gene regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1049-1063 (2011).
  3. Brandes, N., Schmitt, S., Jakob, U. Thiol-based redox switches in eukaryotic proteins. Antioxidants and Redox Signaling. 11 (5), 997-1014 (2009).
  4. Groitl, B., Jakob, U. Thiol-based redox switches. Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (8), 1335-1343 (2014).
  5. Stern, B. D., Wilson, M., Jagus, R. Use of nonreducing SDS-PAGE for monitoring renaturation of recombinant protein synthesis initiation factor, eIF-4 alpha. Protein Expression and Purification. 4 (4), 320-327 (1993).
  6. Gorman, J. J., Wallis, T. P., Pitt, J. J. Protein disulfide bond determination by mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 21 (3), 183-216 (2002).
  7. Li, X., Yang, X., Hoang, V., Liu, Y. H. Characterization of Protein Disulfide Linkages by MS In-Source Dissociation Comparing to CID and ETD Tandem MS. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. , (2018).
  8. Kelly, S. M., Price, N. C. The use of circular dichroism in the investigation of protein structure and function. Current Protein and Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).
  9. Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 927585 (2010).
  10. Gavrilov, A., Razin, S. V., Cavalli, G. In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 163-165 (2015).
  11. Rotoli, S. M., Jones, J. L., Caradonna, S. J. Cysteine residues contribute to the dimerization and enzymatic activity of human nuclear dUTP nucleotidohydrolase (nDut). Protein Science. , (2018).
  12. Caradonna, S., Muller-Weeks, S. The nature of enzymes involved in uracil-DNA repair: isoform characteristics of proteins responsible for nuclear and mitochondrial genomic integrity. Current Protein and Peptide Science. 2 (4), 335-347 (2001).
  13. Macpherson, L. J., et al. Noxious compounds activate TRPA1 ion channels through covalent modification of cysteines. Nature. 445 (7127), 541-545 (2007).
  14. Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).

Play Video

Cite This Article
Rotoli, S. M., Caradonna, S. J. Combining Non-reducing SDS-PAGE Analysis and Chemical Crosslinking to Detect Multimeric Complexes Stabilized by Disulfide Linkages in Mammalian Cells in Culture. J. Vis. Exp. (147), e59483, doi:10.3791/59483 (2019).

View Video