Genotypebestemmelse af Havanemone under den tidlige udvikling
Summary
Målet med denne protokol er at genotype havanemone Nematostella vectensis under gastrulation uden at ofre embryonet.
Abstract
Beskrevet her er en PCR-baseret protokol til genotype gastrula Stage embryo af anthozoan cnidarian Nematostella vectensis uden at ofre dyrets liv. Efter in vitro befrugtning og de-jellyve, zygoter har lov til at udvikle sig til 24 h ved stuetemperatur for at nå den tidlige-til midten af gastrula fase. Gastrula-embryonerne anbringes derefter på en agrose gel-seng i en Petri skål, der indeholder havvand. Under den dissekere mikroskop, en wolfram nål bruges til kirurgisk adskille en aboral væv fragment fra hvert embryo. Efter operation embryoner får derefter lov til at helbrede og fortsætte udviklingen. Genomisk DNA udvindes fra det isolerede vævs fragment og anvendes som skabelon for locus-specifik PCR. Genotypen kan bestemmes ud fra størrelsen af PCR-produkter eller tilstedeværelse/fravær af allel-specifikke PCR-produkter. Efter operationen sorteres embryoner i henhold til genotypen. Varigheden af hele genotypebestemmelse processen afhænger af antallet af embryoner, der skal screenes, men det minimalt kræver 4 – 5 h. Denne metode kan bruges til at identificere knockout-mutanter fra en genetisk heterogene population af embryoner og muliggør analyser af fænotyper under udvikling.
Introduction
Cnidarians repræsenterer en mangfoldig gruppe af dyr, der omfatter vandmænd, koraller og søanemoner. De er diploblaster, sammensat af ectoderm og endoderm, der er adskilt af en ekstracellulær matrix (mesoglea). CNIDARIA er en søster gruppe til speciose Bilateria, som traditionelle dyremodeller som Drosophila og mus tilhører1. Desuden, CNIDARIA-Bilateria divergens menes at have fundet sted i præ-Cambrian periode2. Som sådan, sammenlignende undersøgelser af cnidarians og bilaterians er afgørende for at få indsigt i biologi af deres seneste fælles forfader. For nylig har Komparativ genomforskning afsløret, at cnidarer og bilaterianere deler mange udviklingsmæssige Toolkit-gener såsom notch og bhlh, hvilket antyder, at deres fælles forfader allerede havde disse gener3. Men, rollen af disse udviklingsmæssige Toolkit gener i den sidste fælles forfader af CNIDARIA og Bilateria er sammenligneligt mindre godt forstået. For at løse dette problem, er det afgørende at studere, hvordan disse dybt bevaret gener fungerer i cnidarians.
En af de spirende cnidariske genetiske modeller er anthozoan Nematostella vectensis. Dens genom er blevet sekvenseret3, og en række genetiske værktøjer, herunder morpholino-mediated gen Knockdown, meganuclease-mediated transgenesis, og crispr-Cas9-mediated gen knockins og Knockouts, er nu tilgængelige for brug i dette dyr. Desuden er Nematostella udvikling relativt godt forstået. Under embryogenese sker gastrulation ved indkrængning4, og embryonet udvikler sig til en frisvømning planula Larva. Planula omdannes derefter til en sessile polyp med en mund og circumoral tentakler. Polyp derefter vokser og når seksuel modenhed.
Crispr-Cas9-medieret målrettet mutagenese anvendes nu rutinemæssigt til at studere genfunktion i nematostella vectensis5,6,7,8,9. At generere knockout mutanter i nematostella, en cocktail, der indeholder locus-specifikke enkelt-guide RNAs og endonuklease Cas9 protein er først injiceres i ubefrugtede eller befrugtede æg til at producere F0 grundlægger dyr, der typisk viser mosaisme. F0 dyr er efterfølgende hævet til seksuel modenhed og krydses med hinanden for at producere en F1 befolkning, en delmængde af som kan være knockout mutanter6. Alternativt kan seksuelt modne F0 dyr krydses med vilde-type dyr til at generere F1 heterozygot dyr, og F1 heterozygoter, der bærer en knockout allel i locus af interesse kan derefter krydses med hinanden for at producere F2 afkom, en fjerdedel heraf forventes at være knockout mutanter5. Begge tilgange kræver en metode til at identificere knockout-mutanter fra en genetisk heterogene population. Polyp tentakler kan anvendes til at udtrække genomisk DNA til genotypebestemmelse6,7. Men i tilfælde, hvor den udviklingsmæssige funktion af det gen af interesse er ved at blive undersøgt, og mutant embryoner ikke når polyp-stadiet (dvs. på grund af larve dødelighed forbundet med mutationen), skal knockout mutanter identificeres tidligt i ontogeny. Beskrevet her er en PCR-baseret protokol til genotype individuelle dyr på gastrula scenen uden at ofre dyret, hvilket gør det muligt at identificere knockout-mutanter fra en genetisk heterogene population af embryoner. Varigheden af hele genotypebestemmelse processen afhænger af antallet af embryoner, der skal screenes, men det minimalt kræver 4-5 h.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beskrevet her en PCR-baseret protokol til genotype et enkelt havanemone embryo uden at ofre dyret. Efter gyde og de-jellyve, de befrugtede æg får lov til at udvikle sig til gastrulae. Den aborale region af hvert gastrula-embryon fjernes kirurgisk, og det isolerede aborale væv anvendes til efterfølgende genomisk DNA-ekstraktion, mens de resterende embryoner fra efter operationen heler og fortsætter udviklingen. GDNA-ekstrakterne anvendes derefter til en PCR-analyse for at bestemme genotypen for hvert embryo. Denne me…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker anonyme anmeldere for kommentarer til den tidligere version af manuskriptet, som forbedrede manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af midler fra University of Arkansas.
Materials
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
References
- Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).
- Erwin, D. H., et al. The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals. Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).
- Putnam, N. H., et al. Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization. Science. 317 (5834), 86-94 (2007).
- Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression. Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).
- Nakanishi, N., Martindale, M. Q. CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone. eLife. 7, e39742 (2018).
- He, S. N., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377 (2018).
- Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nature Communications. 5, 5486 (2014).
- Servetnick, M. D., et al. Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning. Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).
- Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer. Nature Communications. 7, 11694 (2016).
- Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis. Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).
- Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled. Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).
- Shinzato, C., et al. Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change. Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).
- Gold, D. A., et al. The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity. Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).
- Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).
- Momose, T., et al. High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion. Scientific Reports. 8, 11734 (2018).
- Artigas, G. Q., et al. A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia. eLife. 7, e29555 (2018).
