Генотипирование морского анемона во время раннего развития
Summary
Целью этого протокола является генотип морского анемоне Nematostella vectensis во время гастрирования без ущерба для эмбриона.
Abstract
Описано здесь pcR основе протокола генотипа гастрола этап эмбриона anthozoan cnidarian Nematostella vectensis без ущерба для жизни животного. После экстракорпорального оплодотворения и де-желе, зиготы могут развиваться в течение 24 ч при комнатной температуре, чтобы достичь ранней до середины гастральной стадии. Эмбрионы гаструлы затем помещаются на гелевой ложе агарозы в чашке Петри, содержащей морскую воду. Под рассекающим микроскопом вольфрамовая игла используется для хирургического отделения фрагмента асоральной ткани от каждого эмбриона. Послеоперационные эмбрионы затем разрешается залечить и продолжить развитие. Геномная ДНК извлекается из изолированного фрагмента ткани и используется в качестве шаблона для локуса конкретных ПЦР. Генотип может быть определен на основе размера продуктов ПЦР или наличия/отсутствия специфических пЦР-продуктов. Послеоперационные эмбрионы затем сортируются по генотипу. Продолжительность всего процесса генотипирования зависит от количества эмбрионов, которые должны быть обследованы, но это минимально требует 4-5 ч. Этот метод может быть использован для выявления нокаут мутантов из генетически неоднородной популяции эмбрионов и позволяет анализировать фенотипы во время развития.
Introduction
Книдарийцы представляют разнообразную группу животных, которые включают медуз, кораллов и морских анемонов. Это дипобласты, состоящие из эктодерма и эндодерма, которые разделены внеклеточной матрицей (мезоглией). Cnidaria является сестрой группы для speciose Bilateria, к которому традиционные модели животных, таких как Drosophila и Mus принадлежат1. Кроме того, Cnidaria-Bilateria расхождения, как полагают, имели место в докембрийский период2. Таким образом, сравнительные исследования книдарян и двулатерян имеют важное значение для получения понимания биологии их последнего общего предка. Недавно сравнительная геномика показала, что книдарианцы и двулатеры имеют много генов инструментария развития, таких как выемка и bHLH, подразумевая, что их общий предок уже имел эти гены3. Тем не менее, роль этих генов инструментария развития в последнем общем предке Cnidaria и Bilateria сравнительно менее хорошо понимается. Для решения этой проблемы, очень важно изучить, как эти глубоко сохраненные гены функционируют в книдарии.
Одной из новых книдарских генетических моделей является anthozoan Nematostella vectensis. Его геном был секвенирован3, и различные генетические инструменты, в том числе морфолино-опосредованный ген нокдаун, мегануклеазы опосредованного трансгенеза, и CRISPR-Cas9-опосредованные генные стукины и нокауты, теперь доступны для использования в этом животном. Кроме того, развитие Nematostella относительно хорошо понимается. Во время эмбриогенеза, гастрирование происходит путем инвагинации4, и эмбрион превращается в личинку планулы свободного плавания. Планула впоследствии превращается в полип с ессиальным полипом с ртом и околоустными щупальцами. Затем полип растет и достигает половой зрелости.
CRISPR-Cas9-опосредованный целевой мутагенез в настоящее время регулярно используется для изучения функции генов в Nematostella vectensis5,6,7,8,9. Для генерации нокаут мутантов в Nematostella, коктейль, содержащий локус конкретных одного руководства РНК и эндонуклеазы Cas9 белка впервые вводится в неоплодотворенных или оплодотворенных яиц для производства F0 основателя животных, которые обычно показывают, мозаикизма. F0 животных впоследствии подняли до половой зрелости и пересеклись друг с другом, чтобы произвести F1 населения, подмножество которых может быть нокаут мутантов6. Кроме того, сексуально зрелые животные F0 могут быть скрещены с дикими животными типа для создания F1 гетерозиготных животных, и F1 гетерозиготы, которые несут нокаут аллель в локус интереса могут быть пересечены друг с другом для производства F2 потомство, одна четверть из которых, как ожидается, будет нокаут мутантов5. Оба подхода требуют метода выявления нокаут-мутантов из генетически неоднородной популяции. Полипщу можно использовать для извлечения геномной ДНКдля генотипирования 6,7. Однако в тех случаях, когда исследуется функция развития гена интереса и эмбрионы-мутанты не достигают стадии полипа (т.е. из-за личинок летальности, связанной с мутацией), мутации мутантов необходимо выявить на ранних стадиях онтогена. Описано здесь ПЦР-протокол генотипа отдельных животных на стадии гаструлы без ущерба для животного, который позволяет идентифицировать нокаутмутантов из генетически неоднородной популяции эмбрионов. Продолжительность всего процесса генотипирования зависит от количества эмбрионов, которые должны быть обследованы, но это минимально требует 4-5 ч.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описан очерканный здесь протокол на основе ПЦР для генотипа одного морского эмбриона анемона без ущерба для животного. После нереста и де-желе, оплодотворенные яйца могут развиваться в gastrulae. Абраальная область каждого эмбриона гаструлы удаляется хирургическим путем, а изолированная ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим анонимных рецензентов за комментарии к более ранней версии рукописи, которая улучшила рукопись. Эта работа была поддержана за счет средств Университета Арканзаса.
Materials
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
References
- Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).
- Erwin, D. H., et al. The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals. Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).
- Putnam, N. H., et al. Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization. Science. 317 (5834), 86-94 (2007).
- Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression. Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).
- Nakanishi, N., Martindale, M. Q. CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone. eLife. 7, e39742 (2018).
- He, S. N., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377 (2018).
- Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nature Communications. 5, 5486 (2014).
- Servetnick, M. D., et al. Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning. Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).
- Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer. Nature Communications. 7, 11694 (2016).
- Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis. Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).
- Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled. Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).
- Shinzato, C., et al. Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change. Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).
- Gold, D. A., et al. The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity. Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).
- Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).
- Momose, T., et al. High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion. Scientific Reports. 8, 11734 (2018).
- Artigas, G. Q., et al. A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia. eLife. 7, e29555 (2018).
