הגנוזות של כלנית ימית במהלך ההתפתחות המוקדמת
Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא גנוטיפ של כלנית המים ne, שושנת הימים במהלך המאבק מבלי להקריב את העובר.
Abstract
המתואר כאן הוא פרוטוקול ה-PCR כדי גנוטיפ העובר בשלב הגאולה של האנתוזואן לאחר הדלקת הקרום האנוטזיס מבלי להקריב את חיי החיה. בעקבות הפריה חוץ גופית ו-de-jellying, הזיטים מורשים להתפתח 24 שעות בטמפרטורת החדר כדי להגיע לשלב מוקדם עד באמצע הגאולה. העוברים הגאוטרולה מונחים לאחר מכן על מיטת ג’ל בצלחת פטרי המכילה מי ים. תחת מיקרוסקופ מבתר, מחט טונגסטן משמש בניתוח להפריד משבר רקמת הבורג מעובר כל. העוברים לאחר הניתוח מורשים להירפא ולהמשיך בפיתוח. דנ א גנומית מופק מרסיס רקמות מבודדים משמש כתבנית ל-PCR ספציפי לוקוס. ה-גנוטיפ ניתן לקבוע בהתבסס על גודל מוצרי ה-PCR או נוכחות/היעדרות של מוצרי PCR ספציפיים של allele. העוברים לאחר הניתוח ממוינים לאחר מכן לפי ה-גנוטיפ. משך תהליך ההקלדה כולו תלוי במספר העוברים שיוקרנו, אך הדבר מחייב את השעה 4 – 5 h. שיטה זו יכולה לשמש כדי לזהות מוטציות הסתרה מתוך אוכלוסיה הטרוגנית גנטית של עוברים ומאפשר ניתוח של פנוטיפים במהלך הפיתוח.
Introduction
החברה מייצגת קבוצה מגוונת של בעלי חיים הכוללים מדוזה, אלמוגים וכלניות ים. הם דיפלותקיעות, המורכב מעור ומעור, המופרדים על-ידי מטריצה מיגלנת (מזוגליא). Cנדבך היא קבוצת אחיות לסוגז בילוניה, שאליה מודלים מסורתיים של בעלי חיים כגון דרוסוהילה ומיוז שייכים ל- 1. בנוסף, הסטייה מהקטריה-בילוניה התרחשה בתקופה הקדם-קמברנית2. ככזה, מחקרים השוואתיים של בילנים ובילואים חיוניים לקבלת תובנות לגבי הביולוגיה של הקדמון המשותף העדכני ביותר שלהם. לאחרונה, גנומיקה השוואתית גילה כי הקטנים ו bilaterians חולקים הרבה גנים ערכת הכלים התפתחותיים כגון חריץ ו bhlh, רומז כי אבותינו המשותפים כבר היו אלה גנים3. עם זאת, התפקיד של גנים אלה ההתפתחותית הקדמון המשותף האחרון של Cנדבך ו Bilateria הוא זהובה פחות הבין היטב. כדי לטפל בבעיה זו, חשוב ללמוד כיצד לתפקד הגנים העמוקים הללו בתוך הקטרים.
אחד המודלים הגנטיים המתעוררים . הגנום שלה יש רצף3, ומגוון של כלים גנטיים, כולל שורסטינו-בתיווך גנים הסתרה, meganuclease-תיווך טרנסגנזה, ו CRISPR-Cas9-בתיווך גן knockins ו הסתרה, זמינים כעת לשימוש בחיה זו. בנוסף לכך , התפתחות ההתפתחות של הניפה מובנת באופן יחסי. במהלך הembryogenesis, הגסטרוציה מתרחשת על ידי הגבנות4, והעובר מתפתח לזחל בשחייה חופשית. לאחר מכן, הפלולה הופך לפוליפ סלוח עם פה וזרועות מעומות. הפוליפ גדל ומגיע לבגרות מינית.
Crispr-Cas9-בתיווך מוטגנזה ממוקדת המשמש כעת שימוש באופן שגרתי כדי ללמוד את התפקוד הגנטי בתוך להיות סטלה vectensis5,6,7,8,9. כדי ליצור מוטציות הנוקאאוט ב ne, קוקטייל המכיל לוקוס ספציפי מדריך יחיד rnas ו endonuclease Cas9 חלבון מוזרק תחילה לתוך ביצים לא מופרות או מופרות לייצר חיות מייסד F0 בדרך כלל להראות פסיפס. F0 בעלי חיים מוגשים לאחר מכן לבגרות מינית ועברו אחד עם השני כדי לייצר אוכלוסייה F1, תת קבוצה של אשר עשוי להיות מוטציות הנוקאאוט6. לחילופין, בוגרת מינית בעלי חיים F0 יכול להיות חצה עם חיות מסוג פראי כדי ליצור heterozygous בעלי חיים f1, ו f1 הטרוזיטים כי לשאת את אלל הנוקאאוט בתוך מקום העניין יכול אז להיות חצה אחד עם השני כדי לייצר הצאצאים F2, אחד ברבעון מהם צפויים להיות. מוטציות בנוקאאוט5 שתי הגישות דורשות שיטה לזיהוי מוטציות הסתרה מאוכלוסיה הטרוגנית גנטית. הפוליפ זרועות ניתן להשתמש כדי לחלץ דנ א גנומית עבור גנוהקלדה6,7. עם זאת, במקרים שבהם הפונקציה ההתפתחותית של גן העניין היא להיחקר ועוברי מוטציה אינם מגיעים לשלב הפוליפ (כלומר, עקב הפרשות הזחל הקשורות למוטציה), יש לזהות מוטציות הסתרה בתחילת האירוע. המתואר כאן הוא פרוטוקול PCR המבוסס על בעלי חיים בודדים בשלב הגסטרולה מבלי להקריב את בעל החיים, אשר מאפשר זיהוי של מוטציות נוקאאוט מאוכלוסיה הטרוגנית גנטית של עוברים. משך תהליך ההקלדה כולו תלוי במספר העוברים להיות מוקרן, אבל זה מינימלית דורש 4-5 h.
Protocol
Representative Results
Discussion
המתואר כאן פרוטוקול PCR על מנת גנוטיפ בודד העובר כלנית ים מבלי להקריב את החיה. הביצים המוופרות מורשות להתפתח בעקבות ההשאיפה והדה-מיולים. האזור הבורג של העובר כל גאורולה הוא הוסר בניתוח, ואת רקמת הבורג המבודד משמש להפקת DNA הבאים גנומית, בעוד העוברים שלאחר ניתוח שנותרו לרפא ולהמשיך בפיתוח. תמצ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לסוקרים אנונימיים על הערות על הגרסה המוקדמת של כתב היד, ששיפרו את כתב היד. עבודה זו נתמכת על ידי קרנות מאוניברסיטת ארקנסו.
Materials
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
References
- Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).
- Erwin, D. H., et al. The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals. Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).
- Putnam, N. H., et al. Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization. Science. 317 (5834), 86-94 (2007).
- Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression. Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).
- Nakanishi, N., Martindale, M. Q. CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone. eLife. 7, e39742 (2018).
- He, S. N., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377 (2018).
- Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nature Communications. 5, 5486 (2014).
- Servetnick, M. D., et al. Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning. Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).
- Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer. Nature Communications. 7, 11694 (2016).
- Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis. Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).
- Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled. Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).
- Shinzato, C., et al. Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change. Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).
- Gold, D. A., et al. The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity. Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).
- Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).
- Momose, T., et al. High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion. Scientific Reports. 8, 11734 (2018).
- Artigas, G. Q., et al. A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia. eLife. 7, e29555 (2018).
