Genotipizzazione dell'Anemone marino durante lo sviluppo precoce
Summary
L’obiettivo di questo protocollo è quello di genottare l’anemone di mare Nematostella vectensis durante la gastrulation senza sacrificare l’embrione.
Abstract
Descritto qui è un protocollo basato su PCR per genotipare l’embrione dello stadio gastrula del cnidariano anthozoano Nematostella vectensis senza sacrificare la vita dell’animale. Dopo la fecondazione in vitro e la de-jellying, gli zigoti sono autorizzati a svilupparsi per 24 h a temperatura ambiente per raggiungere la fase iniziale-medio gastrula. Gli embrioni di gastrula vengono poi posti su un letto di gel di agarose in un piatto Petri contenente acqua di mare. Al microscopio dissezioso, un ago di tungsteno viene utilizzato per separare chirurgicamente un frammento di tessuto aborale da ogni embrione. Gli embrioni post-chirurgia sono poi autorizzati a guarire e continuare lo sviluppo. Il DNA genomico viene estratto dal frammento di tessuto isolato e utilizzato come modello per la PCR specifica per il locus. Il genotipo può essere determinato in base alle dimensioni dei prodotti PCR o alla presenza/assenza di prodotti PCR specifici per alleli. Gli embrioni post-chirurgia vengono poi ordinati in base al genotipo. La durata dell’intero processo di genotipizzazione dipende dal numero di embrioni da vagliare, ma richiede minimamente 4-5 h. Questo metodo può essere utilizzato per identificare i mutanti knockout provenienti da una popolazione geneticamente eterogenea di embrioni e consente l’analisi dei fenotipi durante lo sviluppo.
Introduction
I cnidariani rappresentano un gruppo eterogeneo di animali che includono meduse, coralli e anemoni di mare. Sono diploblasti, composti da ectodermi ed endodermi separati da una matrice extracellulare (mesoglea). Cnidaria è un gruppo gemello per speciosiare Bilateria, a cui i modelli animali tradizionali come Drosophila e Mus appartengono1. Inoltre, si pensa che la divergenza di Cnidaria-Bilateria si sia verificata nel periodo pre-Cambriano2. Come tale, gli studi comparativi di cnidariani e bilateriani sono essenziali per ottenere informazioni sulla biologia del loro antenato comune più recente. Recentemente, la genomica comparativa ha rivelato che i cnidariani e i bilateriani condividono molti geni del toolkit di sviluppo come tacca e bHLH, il che implica che il loro antenato comune aveva già questi geni3. Tuttavia, il ruolo di questi geni del toolkit di sviluppo nell’ultimo antenato comune di Cnidaria e Bilateria è comparabilmente meno ben compreso. Per affrontare questo problema, è fondamentale studiare come funzionano questi geni profondamente conservati nei cnidariani.
Uno dei modelli genetici cnidariani emergenti è l’antozoo Nematostella vectensis. Il suo genoma è stato sequenziato3, e una varietà di strumenti genetici, tra cui il knockdown genico mediato da morfolino, la transgenesi mediata da meganucle e le knockine e knockout genici mediati da CRISPR-Cas9, sono ora disponibili per l’uso in questo animale. Inoltre, lo sviluppo di Nematostella è relativamente ben compreso. Durante l’embriogenesi, la gastrazione si verifica per invaginazione4e l’embrione si sviluppa in una larva di planula che nuota liberamente. La planula successivamente si trasforma in un polipo sessile con bocca e tentacoli circumorali. Il polipo poi cresce e raggiunge la maturità sessuale.
La mutagenesi mirata mediata da CRISPR-Cas9 è ora abitualmente utilizzata per studiare la funzione genica nella vectensis 5 di Nematostella5,6,7,8,9. Per generare mutanti knockout a Nematostella, un cocktail contenente RNA a guida singola specifici di locus e la proteina Cas9 endonuclease viene iniettato per la prima volta in uova non fecondate o fecondate per produrre animali fondatori F0 che in genere mostrano Mosaicism. Gli animali F0 vengono successivamente allevati alla maturità sessuale e incrociati tra loro per produrre una popolazione di F1, un sottoinsieme dei quali può essere mutanti ad eliminazione diretta6. In alternativa, gli animali F0 sessualmente maturi possono essere incrociati con animali di tipo selvatico per generare animali eterozigoti F1, e gli eterozigoti F1 che portano un allele da urlo nel locus di interesse possono quindi essere incrociati tra loro per produrre F2 prole, un quarto di cui dovrebbero essere mutanti ad eliminazione diretta5. Entrambi gli approcci richiedono un metodo per identificare i mutanti knockout provenienti da una popolazione geneticamente eterogenea. I tentacoli polipici possono essere utilizzati per estrarre il DNA genomico per la genotipizzazione6,7. Tuttavia, nei casi in cui si sta studiando la funzione dello sviluppo del gene di interesse e gli embrioni mutanti non raggiungono lo stadio polipo (cioè a causa della letalità larvale associata alla mutazione), i mutanti knockout devono essere identificati precocemente nell’ontogenesi. Descritto qui è un protocollo basato su PCR per genotipare singoli animali allo stadio gastrula senza sacrificare l’animale, che consente l’identificazione di mutanti knockout da una popolazione geneticamente eterogenea di embrioni. La durata dell’intero processo di genotipizzazione dipende dal numero di embrioni da vagliare, ma richiede minimamente 4-5 h.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descritto qui un protocollo basato su PCR per genotipare un singolo embrione di anemone di mare senza sacrificare l’animale. Dopo la deposizione delle uova e la de-jellying, le uova fecondate sono autorizzate a svilupparsi in gastrulae. La regione aborale di ogni embrione di gastrula viene rimossa chirurgicamente e il tessuto aborale isolato viene utilizzato per la successiva estrazione genomica del DNA, mentre i restanti embrioni post-chirurgia guariscono e continuano lo sviluppo. Gli estratti di gDNA vengono quindi uti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i revisori anonimi per i commenti sulla versione precedente del manoscritto, che ha migliorato il manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi dell’Università dell’Arkansas.
Materials
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
References
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