初期開発におけるアネモネのジェノタイピング
Summary
このプロトコルの目的は、胚を犠牲にすることなく、胃形成中に海アネモネネネメテラステッラベクテンシスを遺伝子入力することです。
Abstract
ここに記載されているのは、動物の生命を犠牲にすることなく、アントゾアン・クニダリアン・ネマトステラ・ヴェテンシスのガストラ期胚を遺伝子型化するPCRベースのプロトコルである。体外受精および脱ゼリーに続いて、ザイゴットは早期から中型ガストルラ段階に達するために室温で24時間の開発を可能にする。ガストラ胚は、海水を含むペトリ皿のアガロースゲルベッドに置かれる。解剖顕微鏡の下では、タングステン針を使用して、各胚から卵巣組織断片を外科的に分離する。手術後の胚は治癒し、発達を続けることを許される。ゲノムDNAは、単離された組織断片から抽出され、遺伝子座特異的PCRのテンプレートとして使用される。遺伝子型は、PCR産物の大きさまたは対立遺伝子特異的PCR産物の有無に基づいて決定することができる。手術後の胚は、遺伝子型に従ってソートされます。ジェノタイピングプロセス全体の持続時間は、スクリーニングする胚の数に依存しますが、最小に4-5時間を必要とします。この方法は、胚の遺伝的に異種集団からのノックアウト変異体を同定し、発達中の現象型の分析を可能にするために使用することができる。
Introduction
クニダリアンはクラゲ、サンゴ、海のアネモネを含む動物の多様なグループを表します。それらは、細胞外マトリックス(メソグレア)によって分離された外皮および内皮から成るジプロプラストである。クニダリアは、ショウジョウバエやムスなどの伝統的な動物モデルが1に属するビラテリアを見極める姉妹グループです。さらに、クニダリア・ビラテリアの発散は、カンブリア紀前の2年に起こったと考えられている。したがって、クニダリアンと二国間の比較研究は、彼らの最も最近の共通の祖先の生物学に関する洞察を得るために不可欠です。最近、比較ゲノミクスは、クニダリアンと二国間の遺伝子がノッチやbHLHなどの多くの発達ツールキット遺伝子を共有していることを明らかにし、彼らの共通の祖先はすでにこれらの遺伝子3を持っていたことを示唆している。しかし、Cnidariaとバイラテリアの最後の共通祖先におけるこれらの発達ツールキット遺伝子の役割は、比較してあまりよく理解されていない。この問題に対処するためには、これらの深く保存された遺伝子がクニダリアンでどのように機能するかを研究することが重要です。
新しいクニダリアン遺伝モデルの一つは、アントゾアン・ネマトステラ・ベクテンシスである。そのゲノムは3を配列し、モルフォリノ媒介遺伝子ノックダウン、メガヌクレアーゼ媒介トランスジェネシス、CRISPR-Cas9媒介遺伝子ノクチンおよびノックアウトを含む様々な遺伝的ツールがこの動物で使用できるようになりました。また、ネマトステラの開発は比較的よく理解されています。胚発生時には、胃形成は浸変4によって起こり、胚は自由泳ぎプラヌラ幼虫に発達する。その後、プラヌラは口と円周触手を持つセッシルポリープに変身します。ポリープは成長し、性的成熟に達します。
CRISPR-Cas9媒介型標的変異体は、現在、ネマトステラベクテンシス5、6、7、8、9の遺伝子機能を研究するために日常的に使用されている。ネマトステラでノックアウト変異体を生成するために、遺伝子座特異的なシングルガイドRNAとエンドヌクレスリースCas9タンパク質を含むカクテルを最初に未受精または受精卵に注入し、F0の創始者の動物を生成する。モザイク。F0動物は、その後、性的成熟に育てられ、F1集団を生成するために互いに交差し、そのサブセットは、変異体6をノックアウトしてもよい。あるいは、性的に成熟したF0動物は、F1ヘテロジゴウス動物を生成するために野生型の動物と交配することができ、興味のある軌跡でノックアウト対立遺伝子を運ぶF1ヘテロジゴットは、F2子孫、四分の一を生成するために互いに交差することができますそのうちの5はノックアウト変異体であると予想される。どちらのアプローチも、遺伝的に異種集団からノックアウト変異体を同定する方法を必要とする。ポリープ触手は、ジェノタイピング6、7のためのゲノムDNAを抽出するために使用することができます。しかし、対象遺伝子の発達機能が調査され、変異胚がポリープ段階に達しない場合(すなわち、変異に関連する幼虫致死性のために)、ノックアウト変異体を早期に同定する必要がある。ここで説明するPCRベースのプロトコルは、動物を犠牲にすることなく、ガストラ段階で個々の動物を遺伝子型化するプロトコルであり、これは胚の遺伝的に異種集団からのノックアウト変異体の同定を可能にする。ジェノタイピングプロセス全体の持続時間は、スクリーニングする胚の数に依存しますが、最小限に4〜5時間を必要とします。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、動物を犠牲にすることなく単一の海アネモネ胚を遺伝子型化するPCRベースのプロトコルを説明する。産卵および脱ゼリーに続いて、受精卵はガストラーに発達することを許される。各ガストラ胚の卵巣領域は外科的に除去され、その後のゲノムDNA抽出に単離された卵巣組織が使用され、残りの手術後の胚は治癒し、発達を続ける。次に、gDNA抽出物をPCRアッセイに使用して、各胚の…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、原稿を改善した原稿の以前のバージョンに関するコメントのための匿名のレビュー担当者に感謝します。この研究はアーカンソー大学の資金によって支えられた。
Materials
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
References
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