초기 개발 중 바다 말미잘의 지질 형질이
Summary
이 프로토콜의 목표는 배아를 희생하지 않고 위도 동안 말미잘 성충을 유전자 형화하는것입니다.
Abstract
여기서 설명된 PCR-기반 프로토콜은 동물의 생명을 희생시키지 않고 안토조안 성충성 네마토스텔라 의 기압기 배아를 유전자형화한다. 체외 수정 및 탈 젤리에 이어, zygotes는 초기 – 중간 gastrula 단계에 도달하기 위해 실온에서 24 시간 동안 개발할 수 있습니다. 가스트룰라 배아는 다음 해수를 포함하는 페트리 접시에 아가로즈 젤 침대에 배치됩니다. 해부 현미경의 밑에, 텅스텐 바늘은 외과로 각 태아에서 aboral 조직 단편을 분리하기 위하여 이용됩니다. 수술 후 배아는 치유하고 개발을 계속할 수 있습니다. 게놈 DNA는 단리된 조직 단편으로부터 추출되고 궤적 특이적 PCR에 대한 템플릿으로서 사용된다. 유전자형은 PCR 제품의 크기 또는 대문자 특정 PCR 제품의 유무에 따라 결정될 수 있습니다. 수술 후 배아는 유전자형에 따라 분류됩니다. 전체 지질 형질 검사 과정의 기간은 선별 될 배아의 수에 따라 다르지만 최소한 4-5 시간이 필요합니다. 이 방법은 배아의 유전이 종족적인 인구에서 녹아웃 돌연변이를 확인하고 발달 도중 표현형의 분석을 가능하게 하기 위하여 이용될 수 있습니다.
Introduction
Cnidarians는 해파리, 산호 및 바다 말미잘을 포함하는 동물의 다양한 그룹을 나타냅니다. 그(것)들은 세포외 매트릭스 (mesoglea)에 의해 분리되는 외엽과 내배엽으로 구성된 diploblasts입니다. Cnidaria는 초파리와 무스와 같은 전통적인 동물 모델이 1에 속하는 Bilateria를추측하는 자매 그룹입니다. 또한, Cnidaria-Bilateria 발산은 캄브리아기 이전 기간에 발생 한 것으로 생각된다2. 이와 같이, cnidarians와 양자학자의 비교 연구는 그들의 가장 최근의 일반적인 조상의 생물학에 대한 통찰력을 얻기 를 위해 필수적입니다. 최근, 비교 유전체학은 cnidarians와 양자학자가 노치와 bHLH와 같은 많은 발달 툴킷 유전자를 공유한다는 것을 밝혔습니다, 그들의 일반적인 조상이 이미 이 유전자3가 있었다는 것을 암시하. 그러나, Cnidaria와 Bilateria의 마지막 일반적인 조상에 있는 이 발달 공구 키트 유전자의 역할은 비교적 적게 잘 이해됩니다. 이 문제를 해결하기 위하여는, 이 깊이 보존한 유전자가 cnidarians에 있는 어떻게 작동하는지 공부하는 것이 중요합니다.
신흥 세포주의 유전 모델 중 하나는 안토조안 네마토스텔라 정맥학입니다. 그것의 게놈은3,및 모폴리노 매개 유전자 녹다운, meganuclease 중재한 기형성, 및 CRISPR-Cas9 중재한 유전자 녹진 및 녹아웃을 포함하여 다양한 유전 공구가 지금 이 동물에서 유효하게 유효합니다. 또한, 네마토스텔라 개발은 비교적 잘 이해된다. 배아 발생 시, 위분은 질4에 의해 발생하며, 배아는 자유 수영 플라눌라 유충으로 발전합니다. 플래눌라는 이후 입과 경부 촉수와 sessile 폴리페로 변환합니다. 용종은 성장하고 성숙에 도달합니다.
CRISPR-Cas9 매개 표적 돌연변이 발생은 이제 일상적으로 Nematostella 정맥염5,6,7,8,9에서 유전자 기능을 연구하는 데 사용됩니다. Nematostella에서녹아웃 돌연변이를 생성하기 위해, 궤적 특이적 단일 가이드 RNA와 endonuclease Cas9 단백질을 포함하는 칵테일은 먼저 일반적으로 보여주는 F0 창시자 동물을 생산하기 위해 비옥한 또는 기름지게 한 계란에 주입됩니다. 모자이크. F0 동물은 이후에 성숙도에 제기되고 F1 집단을 생성하기 위해 서로 교차되고, 그중 부분 집합은 녹아웃 돌연변이체일 수 있다 6. 또는, 성적으로 성숙한 F0 동물은 F1 이형 동물을 생성하기 위해 야생 형 동물과 교차 할 수 있으며, 관심의 궤적에 녹아웃 대립 유전자를 운반하는 F1 이형은 F2 자손을 생산하기 위해 서로 교차 할 수 있습니다, 1 분기 그 중 녹아웃 돌연변이 가 될 것으로 예상된다5. 두 접근은 유전으로 이질적인 인구에서 녹아웃 돌연변이를 확인하는 방법을 요구합니다. 폴립 촉수는 6,7. 그러나 관심 있는 유전자의 발달 기능이 조사되고 돌연변이 배아가 폴립 단계에 도달하지 않는 경우(즉, 돌연변이와 관련된 애벌레 치사성으로 인해), 녹아웃 돌연변이는 초기에 확인되어야 합니다. 여기에 설명된 PCR 기반 프로토콜은 동물을 희생시키지 않고 가스트루라 단계에서 개별 동물을 유전자형으로 하는 것으로, 이는 배아의 유전적 이질적인 집단으로부터 녹아웃 돌연변이체의 식별을 가능하게 한다. 전체 지질 형질 검사 과정의 기간은 선별 될 배아의 수에 따라 다르지만 최소한 4-5 시간이 필요합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 동물을 희생시키지 않고 단일 말미잘 배아를 유전자형화하는 PCR 기반 프로토콜을 기술한다. 산란 과 탈 젤리 다음, 수정된 계란은 gastrulae로 발전하는 것을 허용됩니다. 각 gastrula 배아의 복부 영역은 외과적으로 제거되고, 분리된 아포랄 조직은 후속 게놈 DNA 추출을 위해 사용되며, 나머지 수술 후 배아는 치유되고 개발을 계속한다. gDNA 추출물은 각 배아의 유전자형을 결정하기 위해 PCR 분?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
원고를 개선한 원고의 이전 버전에 대한 의견에 대해 익명의 검토자에게 감사드립니다. 이 작품은 아칸소 대학의 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
References
- Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).
- Erwin, D. H., et al. The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals. Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).
- Putnam, N. H., et al. Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization. Science. 317 (5834), 86-94 (2007).
- Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression. Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).
- Nakanishi, N., Martindale, M. Q. CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone. eLife. 7, e39742 (2018).
- He, S. N., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377 (2018).
- Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nature Communications. 5, 5486 (2014).
- Servetnick, M. D., et al. Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning. Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).
- Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer. Nature Communications. 7, 11694 (2016).
- Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis. Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).
- Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled. Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).
- Shinzato, C., et al. Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change. Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).
- Gold, D. A., et al. The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity. Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).
- Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).
- Momose, T., et al. High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion. Scientific Reports. 8, 11734 (2018).
- Artigas, G. Q., et al. A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia. eLife. 7, e29555 (2018).
