Genotypning av Havanemon under tidig utveckling
Summary
Målet med detta protokoll är att genotyp havanemon Nematostella vectensis under gastrulation utan att offra embryot.
Abstract
Beskrivs här är ett PCR-baserat protokoll till genotyp den gastrulastadium skede embryot av Robotskapade stubbar om artikel om Nematostella vectensis utan att offra livet av djuret. Efter in vitro -fertilisering och de-jellying, zygoter får utvecklas för 24 h vid rumstemperatur för att nå början till mitten av gastrula skede. De gastrulastadium embryona placeras sedan på en aguppstod gel säng i en petriskål som innehåller havsvatten. Under dissekera Mikroskop, en Volfram nål används för att kirurgiskt separera ett aboral vävnad fragment från varje embryo. Efter operationen embryon får sedan läka och fortsätta utvecklingen. Genomiskt DNA extraheras från det isolerade vävnads fragmentet och används som mall för Locus-specifik PCR. Genotypen kan bestämmas utifrån storleken på PCR-produkter eller förekomst/frånvaro av allelespecifika PCR-produkter. Efter operationen embryon sorteras sedan efter genotyp. Varaktigheten av hela genotypningen beror på antalet embryon som ska screenas, men det kräver minimalt 4 – 5 timmar. Denna metod kan användas för att identifiera knockout-mutanter från en genetiskt heterogen population av embryon och möjliggör analyser av fenotyper under utvecklingen.
Introduction
Cnidarians representerar en mångsidig grupp av djur som inkluderar maneter, koraller och havsöroner. De är diploblaster, består av ektoderm och endoderm som separeras av en extracellulär matris (mesoglea). Cnidaria är en syster grupp till speciose Bilateria, som traditionella djur modellerar liksom Drosophila och mus hör hemma till1. Dessutom är Cnidaria-Bilateria divergensen tros ha inträffat i pre-kambriska perioden2. Som sådan, jämförande studier av koraller och bilaterians är viktiga för att få insikter i biologi deras senaste gemensamma förfader. Nyligen har komparativ genomik visat att koraller och bilaterians dela många utvecklingsverktyg gener såsom notch och bhlh, vilket innebär att deras gemensamma förfader redan hade dessa gener3. Men den roll som dessa utvecklingsverktyg gener i den sista gemensamma förfader Cnidaria och Bilateria är jämförbart mindre väl förstått. För att lösa detta problem är det viktigt att studera hur dessa djupt bevarade gener fungerar i cnidarians.
En av de framväxande artikel om genetiska modellerna är Robotskapade stubbar om Nematostella vectensis. Dess genom har sekvenserat3, och en mängd olika genetiska verktyg, inklusive morpholino-medierad Gene knockdown, meganuclease-medierad transgenes, och CRISPR-Cas9-medierade genknockins och Knockouts, finns nu tillgängliga för användning i detta djur. Dessutom är Nematostella utveckling relativt väl förstått. Under embryogenes, gastrulation sker genom invagination4, och embryot utvecklas till en fri-simning planula larv. Planula förvandlas därefter till ett oskaftade polyp med en mun och cirkumoral tentakler. Den polyp växer sedan och når sexuell mognad.
CRISPR-Cas9-medierad riktad mutagenes används nu rutinmässigt för att studera genfunktion i Nematostella vectensis5,6,7,8,9. För att generera knockout mutanter i Nematostella, en cocktail som innehåller Locus-specifika Single-guide rnas och Endonuklease Cas9 protein injiceras först i obefruktad eller befruktade ägg för att producera F0 grundare djur som typiskt visar mosaicism. F0 djur höjs därefter till sexuell mognad och korsas med varandra för att producera en F1-population, varav en delmängd kan vara knockout mutanter6. Alternativt kan sexuellt mogna F0 djur korsas med vildtyp djur för att generera F1 heterozygot djur, och F1 heterozygoter som bär en knockout allel i Locus av intresse kan sedan korsas med varandra för att producera F2 avkomma, en fjärdedel som förväntas bli knockout mutanter5. Båda metoderna kräver en metod för att identifiera knockout mutanter från en genetiskt heterogen population. Polyp tentakler kan användas för att extrahera genomiskt DNA för genotypning6,7. Men i de fall där utvecklings funktionen av genen av intresse utreds och mutanta embryon inte når polyp Stadium (dvs. på grund av larv dödlighet i samband med mutationen), knockout mutanter måste identifieras tidigt i Ontogeni. Beskrivs här är ett PCR-baserat protokoll till genotyp enskilda djur på gastrulastadium scenen utan att offra djuret, vilket möjliggör identifiering av knockout mutanter från en genetiskt heterogena population av embryon. Varaktigheten av hela genotypning processen beror på antalet embryon som skall screenas, men det minimalt kräver 4-5 h.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beskrivs här ett PCR-baserat protokoll till genotyp ett enda hav Anemon embryo utan att offra djuret. Efter lek och de-jellying, de befruktade äggen får utvecklas till gastrulae. Aboral regionen av varje gastrulastadium embryo avlägsnas kirurgiskt, och den isolerade aboral vävnad används för efterföljande genomisk DNA-extraktion, medan de återstående efter operationen embryon läka och fortsätta utvecklingen. GDNA-extrakt används sedan för en PCR-analys för att bestämma genotypen för varje embryo. Denna m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar anonyma granskare för kommentarer om den tidigare versionen av manuskriptet, vilket förbättrade manuskriptet. Detta arbete stöddes av medel från University of Arkansas.
Materials
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
References
- Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).
- Erwin, D. H., et al. The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals. Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).
- Putnam, N. H., et al. Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization. Science. 317 (5834), 86-94 (2007).
- Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression. Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).
- Nakanishi, N., Martindale, M. Q. CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone. eLife. 7, e39742 (2018).
- He, S. N., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377 (2018).
- Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nature Communications. 5, 5486 (2014).
- Servetnick, M. D., et al. Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning. Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).
- Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer. Nature Communications. 7, 11694 (2016).
- Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis. Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).
- Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled. Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).
- Shinzato, C., et al. Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change. Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).
- Gold, D. A., et al. The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity. Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).
- Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).
- Momose, T., et al. High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion. Scientific Reports. 8, 11734 (2018).
- Artigas, G. Q., et al. A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia. eLife. 7, e29555 (2018).
