Изучение Cryptosporidium инфекции в 3D Ткани полученных человеческих органоидных систем культуры микроинъекции
Summary
Мы описываем протоколы для подготовки яйцеклеток и очищения спорозоитов для изучения инфекции органов кишечника и дыхательных путей с помощью Cryptosporidium parvum. Мы демонстрируем процедуры микроинъекции паразитов в кишечный органоидный просвет и иммуностоидинг органоидов. Наконец, мы описываем изоляцию генерируемых яйцеклеток от органоидов.
Abstract
Cryptosporidium parvum является одной из основных причин заболеваний человека диареи. Чтобы понять патологию паразита и разработать эффективные препараты, необходима система культуры in vitro, которая переоценивает условия в хозяине. Органоиды, которые очень похожи на ткани своего происхождения, идеально подходят для изучения взаимодействий хозяина-паразита. Органоиды являются трехмерными (3D) тканевыми структурами, которые получены из взрослых стволовых клеток и растут в культуре в течение длительных периодов времени, не подвергаясь никакой генетической аберрации или трансформации. Они имеют четко определенную полярность как с апиальными, так и с базолатеральными поверхностями. Органоиды имеют различные применения в тестировании на наркотики, био-банкинг, и болезни моделирования и принимающей микробов исследований взаимодействия. Здесь мы представляем пошаговый протокол о том, как подготовить яйцеклетки и спорозоиты криптоспоридия для заражения органов кишечника и дыхательных путей человека. Затем мы демонстрируем, как микроинъекция может быть использована для введения микробов в органоидный просвет. Существует три основных метода, с помощью которых органоиды могут быть использованы для исследований взаимодействия хозяина-микроба – микроинъекций, механического стрижки и покрытия, а также путем создания монослойных. Микроинъекция позволяет успомянить 3D-структуру и обеспечивает точный контроль объемов паразитов и прямого апкиальный боковой контакт для микробов. Мы предоставляем подробную информацию для оптимального роста органоидов для визуализации или производства яйцеклеток. Наконец, мы также демонстрируем, как вновь сгенерированные яйцеклетки могут быть изолированы от органоида для дальнейшей обработки и анализа вниз по течению.
Introduction
Разработка лекарств или вакцин для лечения и профилактики инфекции Cryptosporidium была затруднена из-за отсутствия систем in vitro, которые точно имитируют in vivo ситуацию в организме человека1,2. Многие из имеющихся в настоящее время систем либо позволяют краткосрочную инфекцию (Злт;5 дней), либо не поддерживают полный жизненный цикл паразита3,4. Другие системы, которые позволяют полное развитие паразита основаны на увековеченных клеточных линий или раковых клеток линий, которые не точно резюмировать физиологическую ситуацию в организме человека5,6,7 . Органоиды или «мини-органы» являются 3D-структурами, полученными из тканей, которые выращиваются во внеклеточной матрице, дополненной различными специфическими факторами роста тканей. Органоиды были разработаны из различных органов и тканей. Они генетически стабильны и резюмируют большинство функций органов их происхождения и могут поддерживаться в культуре в течение длительных периодов времени. Мы разработали метод заражения органов кишечника и легких человека криптоспоридием, который обеспечивает точную модель in vitro для изучения взаимодействий хозяина-паразита, имеющих отношение к кишечному и респираторному криптоспоридиозу8 ,9,10,11,12,13. В отличие от других опубликованных моделей культуры, органоидная система является репрезентативной для взаимодействия паразитов в реальной жизни, позволяет завершить жизненный цикл, чтобы можно было изучить все этапы жизненного цикла паразита, и поддерживает распространение паразитов на срок до 28 дней10.
Cryptosporidium parvum является апикомплексным паразитом, который заражает эпителий дыхательных путей и кишечных путей, вызывая длительную диарею. Устойчивый экологический этап является яйцей, найденный в загрязненной пище и воде14. После того, как попадает или вдыхается, яйцеклетки excyst и выпускает четыре sporozoites, которые прикрепляются к эпителиальным клеткам. Sporozoites скользить по клеткам хозяев и заниматься рецепторами клеток-хозяев, но паразит не полностью вторгнуться в клетку, и, как представляется, побудить клетку-хозяина, чтобы поглотить его15. Паразит, который интернализирован в внутриклеточном, но экстрацитоплазматном отсеке, остается на апической поверхности клетки, реплицируя в паразитофорном вакуоле. Он проходит два раунда бесполого размножения – процесс, называемый мерогонии. Во время мерогонии, типа I меронты развиваться, которые содержат восемь merozoites, которые выпускаются вторгнуться в новые клетки. Эти мерозоиты вторгаются в новые клетки, чтобы превратиться в меронты типа II, содержащие четыре мерозоита. Эти мерозоиты, когда высвобождаются, заражают клетки и превращаются в макрогамонты и микрогамонты. Микрогаметы высвобождаются и удобряют макрогаметы, производящие зиготы, которые созревают в ооцисты. Зрелые яйцеклетки впоследствии высвобождаются в просвет. Ооцисты либо тонкостены, которые сразу же excyst для повторного заражения эпителия, или толстые стеной, которые высвобождаются в окружающую среду, чтобы заразить следующий хозяин14. Все этапы жизненного цикла Cryptosporidium были определены в системе органоидной культуры, ранее разработанной нашей группой10.
Так как человеческие органоиды верно реплицируют человеческие ткани9,11,13,и поддерживают все репликационные этапы Cryptosporidium10, они являются идеальной системой культуры тканей для изучения Криптоспоридий биологии и принимающей паразит взаимодействия. Здесь мы описываем процедуры заражения органоидов как с Cryptosporidium яйцевидных яйцеклеток и excysted sporozoites, и изоляции новых яйцеклеток, производимых в этой системе культуры тканей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Культура паразитов Cryptosporidium в кишечных и дыхательных органах обеспечивает точную модель для изучения взаимодействия хозяина-паразита10, но также имеет много других применений. Например, современные методы отбора и распространения генетически модифицированных параз?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признательны Деборе А. Шефер из Школы животных и сравнительных биомедицинских наук, Колледжа сельского хозяйства и наук о жизни, Университета Аризоны, Тусона, ак, США за помощь в производстве и анализе яйцеклеток. Мы также благодарим Франчески Микроскопия и Imaging центр и Д. Л. Mullendore в Университете штата Вашингтон для TEM подготовки и визуализации изолированных органоидных ооц.
Д.Д. является получателем гранта VENI от Нидерландской организации научных исследований (NWO-ALW, 016.Veni.171.015). I.H. является получателем гранта VENI от Нидерландской организации научных исследований (NWO-ALW, 863.14.002) и поддерживается стипендией Марии Кюри от Европейской комиссии (Предложение 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). Исследования, приведшие к этим результатам, получили финансирование от Европейского исследовательского совета в соответствии с Соглашением о расширенных грантах ERC No 67013 и от NIH NIAIH в соответствии с R21 AT009174 в RMO. Эта работа является частью Института Oncode, который частично финансируется Голландским онкологическим обществом и финансируется за счет гранта Голландского онкологического общества.
Materials
| Basement membrane extract (extracellular matrix) | amsbio | 3533-010-02 | |
| Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody) | Waterborne, Inc | A400FLR-1X | Final Concentration = Use 2-3 drops/slide |
| Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads | Waterborne, Inc | IMS400-20 | |
| Dynamag 15 rack | Thermofisher Scientific | 12301D | |
| Dynamag 2 rack | Thermofisher Scientific | 12321D | |
| EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µm | EMD-Millipore | TSTP02500 | |
| Fast green dye | SIGMA | F7252-5G | |
| Femtojet 4i Microinjector | Eppendorf | 5252000013 | |
| Glass capillaries of 1 mm diameter | WPI | TW100F-4 | |
| Matrigel (extracellular matrix) | Corning | 356237 | |
| Microfuge tube 1.5ml | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Micro-loader tips | Eppendorf | 612-7933 | |
| Micropipette puller P-97 | Shutter instrument | P-97 | |
| Normal donkey Serum | Bio-Rad | C06SB | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium hypoclorite (use 5%) | Clorox | 50371478 | |
| Super stick slides | Waterborne, Inc | S100-3 | |
| Swinnex-25 47mm Polycarbonate filter holder | EMD-Millipore | SX0002500 | |
| Taurocholic acid sodium salt hydrate | SIGMA | T4009-5G | |
| Tween-20 | Merck | 8221840500 | |
| Vectashield mounting agent | Vector Labs | H-1000 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries, Inc | SI0236 | |
| Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes) | Final amount | ||
| DMEM | Invitrogen | 12634-010 | 500ml |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| Glutamax | Gibco | 35050038 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| Hepes | Gibco | 15630056 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media) | Final concentration | ||
| A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 0.5µM |
| Adv+++ | make upto 100 ml | ||
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 1X |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50ng/mL |
| Gastrin | Tocris | 3006-1mg | 10 nM |
| NAC | Sigma | A9125-25G | 1.25mM |
| NIC | Sigma | N0636-100G | 10mM |
| Noggin CM | In house* | 10% | |
| P38 inhibitor (SB202190) | Sigma | S7076-25 mg | 10µM |
| PGE2 | Tocris | 2296/10 | 10 nM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1ml/500ml media |
| RSpoI CM | In house* | 20% | |
| Wnt3a CM | In house* | 50% | |
| In house* – cell lines will be provided upon request | |||
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media) | To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME) | ||
| LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media) | Final concentration | ||
| Adv+++ | make upto 100 ml | ||
| ALK-I A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 500nM |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 0.0763888889 |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100ng/ml |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 25ng/ml |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9125-25G | 1.25mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 5mM |
| Noggin UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| p38 MAPK-I | Sigma | S7076-25 mg | 1µM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1:500 |
| RhoKI Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817_100 mg | 2.5µm |
| Rspo UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection) | Final concentration | ||
| L-Glutathione reduced | Sigma | G4251-10MG | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Betaine | Sigma | 61962 | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| L-Cysteine | Sigma | 168149-2.5G | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Linoleic acid | Sigma | L1376-10MG | 6.8 μg/ml of OME/OMD /LOM |
| Taurine | Sigma | T0625-10MG | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Blocking buffer (for immunoflourescence staining) | Final concentration | ||
| Donkey/Goat serum | Bio-Rad | C06SB | 2% |
| PBS | Thermo-Fisher | 70011044 | Make upto 100ml |
| Tween 20 | Merck | P1379 | 0.1% |
| List of Antibodies used | |||
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Invitrogen | A-11011 | Dilution-1:500; RRID: AB_143157 |
| Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo | Waterborne, Inc | A400FLK | Dilution- 1:200 |
| Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive | Waterborne, Inc | IMS400-20 | Dilution-1:500 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Dilution-1:1000; RRID : AB_2629482 |
| Phalloidin-Alexa 674 | Invitrogen | A22287 | Dilution-1:1000; RRID: AB_2620155 |
| Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author). | Upon request | Upon request | Dilution-1:500 |
| Sporo-Glo | Waterborne, Inc | A600FLR-1X | Dilution- 1:200 |
References
- Checkley, W., et al. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium. The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).
- Bones, A. J., et al. Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research. Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).
- Muller, J., Hemphill, A. In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals. International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).
- Karanis, P., Aldeyarbi, H. M. Evolution of Cryptosporidium in vitro culture. International Journal for Parasitology. 41 (12), 1231-1242 (2011).
- Morada, M., et al. Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology. International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).
- DeCicco RePass, M. A., et al. Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum. Infection and Immunity. 85 (3), (2017).
- Miller, C. N., et al. A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology. International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modelling. bioRxiv. , (2018).
- Dutta, D., Clevers, H. Organoid culture systems to study host-pathogen interactions. Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- O’Hara, S. P., Chen, X. M. The cell biology of Cryptosporidium infection. Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).
- Lendner, M., Daugschies, A. Cryptosporidium infections: molecular advances. Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).
- Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells. Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).
- O’Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens. Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).
- Wilke, G., et al. Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro. mSphere. 3 (3), (2018).
- Vinayak, S., et al. Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum. Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
