Studium der Cryptosporidium-Infektion in 3D-Gewebe-abgeleiteten Human Organoid Culture Systems durch Mikroinjektion
Summary
Wir beschreiben Protokolle zur Vorbereitung von Oozysten und zur Reinigung von Sporozoiten zur Untersuchung der Infektion von menschlichen Darm- und Atemwegsorganoiden durch Cryptosporidium parvum. Wir zeigen die Verfahren für die Mikroinjektion von Parasiten in das Darmorganoidlumen und die Immunfärbung von Organoiden. Schließlich beschreiben wir die Isolierung der erzeugten Oozysten von den Organoiden.
Abstract
Cryptosporidium parvum ist eine der Hauptursachen für menschliche Durchfallerkrankungen. Um die Pathologie des Parasiten zu verstehen und effiziente Medikamente zu entwickeln, ist ein In-vitro-Kultursystem erforderlich, das die Bedingungen im Wirt rekapituliert. Organoide, die den Geweben ihrer Herkunft sehr ähnlich sind, sind ideal für die Untersuchung von Wirtsparasiten-Wechselwirkungen. Organoide sind dreidimensionale (3D) Gewebe-abgeleitete Strukturen, die aus adulten Stammzellen abgeleitet werden und über einen längeren Zeitraum in kulturgemäß wachsen, ohne eine genetische Aberration oder Transformation zu durchlaufen. Sie haben eine gut definierte Polarität mit apikalen und basolateralen Oberflächen. Organoide haben verschiedene Anwendungen in Medikamententests, Bio-Banking, und Krankheitsmodellierung und Wirt-Mikroben-Interaktionsstudien. Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll vor, wie man die Oozysten und Sporozoiten von Cryptosporidium für die Infektion menschlicher Darm- und Atemwegsorganoide vorbereitet. Wir zeigen dann, wie Mikroinjektion verwendet werden kann, um die Mikroben in das Organoidlumen zu injizieren. Es gibt drei Hauptmethoden, mit denen Organoide für Wirt-Mikroben-Interaktionsstudien verwendet werden können: Mikroinjektion, mechanisches Scheren und Plattieren und durch die Herstellung von Monolayern. Die Mikroinjektion ermöglicht die Erhaltung der 3D-Struktur und ermöglicht eine präzise Kontrolle der Parasitenvolumina und den direkten apikalen Seitenkontakt für die Mikroben. Wir liefern Details für ein optimales Wachstum von Organoiden für die Bildgebung oder Oozystenproduktion. Schließlich zeigen wir auch, wie die neu erzeugten Oozysten aus dem Organoid für die weitere Weiterverarbeitung und Analyse isoliert werden können.
Introduction
Die Entwicklung von Medikamenten oder Impfstoffen zur Behandlung und Vorbeugung von Cryptosporidium-Infektionen wurde durch das Fehlen von In-vitro-Systemen behindert, die die In-vivo-Situation beim Menschen genau nachahmen1,2. Viele der derzeit verfügbaren Systeme erlauben entweder nur eine kurzfristige Infektion (<5 Tage) oder unterstützen nicht den gesamten Lebenszyklus des Parasiten3,4. Andere Systeme, die die vollständige Entwicklung des Parasiten ermöglichen, basieren auf verewigten Zelllinien oder Krebszelllinien, die die physiologische Situation beim Menschen nicht getreu rekapitulieren5,6,7 . Organoide oder “Mini-Organe” sind 3D-Gewebe abgeleitete Strukturen, die in einer extrazellulären Matrix mit verschiedenen gewebespezifischen Wachstumsfaktoren ergänzt angebaut werden. Organoide wurden aus verschiedenen Organen und Geweben entwickelt. Sie sind genetisch stabil und rekapitulieren die meisten Funktionen der Organe ihrer Herkunft und können in der Kultur für längere Zeit erhalten werden. Wir haben eine Methode zur Infizierung menschlicher Darm- und Lungenorganoide mit Cryptosporidium entwickelt, die ein genaues In-vitro-Modell für die Untersuchung von Wirtsparasiten-Wechselwirkungen bietet, die für die Darm- und Atemkryptosporidiose relevant sind8 ,9,10,11,12,13. Im Gegensatz zu anderen veröffentlichten Kulturmodellen ist das Organoidsystem repräsentativ für reale Wirtparasiten-Wechselwirkungen, ermöglicht die Vollendung des Lebenszyklus, so dass alle Stadien des Parasiten-Lebenszyklus untersucht werden können, und hält die Parasitenausbreitung aufrecht. für bis zu 28 Tage10.
Cryptosporidium parvum ist ein apicomplexan Parasit, der das Epithel der Atemwege und Darmtrakt infiziert, verursacht längere Durchfallerkrankungen. Die resistente Umweltstufe ist die Oozyste, die in kontaminierten Lebensmitteln und Wasser gefunden wird14. Nach der Ein- oder Einatmung exzyst die Oozyste und setzt vier Sporozoiten frei, die sich an Epithelzellen anheften. Sporozoiten gleiten auf Wirtszellen und greifen Wirtszellrezeptoren an, aber der Parasit dringt nicht vollständig in die Zelle ein und scheint die Wirtszelle dazu zu bringen, sie zu verschlingen15. Der Parasit, der in einem intrazellulären, aber extrazytoplasmatischen Fach verinnerlicht wird, verbleibt an der apikalen Oberfläche der Zelle und replizieren sich innerhalb eines parasitophorischen Vakuols. Es durchläuft zwei Runden asexueller Fortpflanzung – ein Prozess, der Merogonie genannt wird. Während der Merogonie entwickeln typ I Meronts, die acht Merozoiten enthalten, die freigesetzt werden, um in neue Zellen einzudringen. Diese Merozoiten dringen in neue Zellen ein, um sich zu Typ-II-Meronten zu entwickeln, die vier Merozoiten enthalten. Diese Merozoiten infizieren bei ihrer Freigabe Zellen und entwickeln sich zu Makrogamonts und Mikrogamonen. Mikrogamete werden freigesetzt und befruchten die Makrogameten, die Zygoten produzieren, die zu Oozysten reifen. Reife Oozysten werden anschließend in das Lumen freigesetzt. Oozysten sind entweder dünnwandige, die sofort exzyst, um das Epithel neu zu infizieren, oder dick wandgebunden, die in die Umwelt freigesetzt werden, um den nächsten Wirt14zu infizieren. Alle Stadien des Cryptosporidium-Lebenszyklus wurden in dem zuvor von unserer Gruppe10entwickelten Organoid-Kultursystem identifiziert.
Da menschliche Organoide das menschliche Gewebe9,11,13originalgetreu replizieren und alle replizierenden Stadien von Cryptosporidium10unterstützen, sind sie das ideale Gewebekultursystem zum Studium Cryptosporidium Biologie und Wirt-Parasiten-Wechselwirkungen. Hier beschreiben wir die Verfahren zur Infizierung von Organoiden mit Cryptosporidium-Oozysten und exzysierten Sporozoiten und zur Isolierung der neuen Oozysten, die in diesem Gewebekultursystem produziert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kultur von Cryptosporidium Parasiten in Darm- und Atemwegsorganoiden bietet ein genaues Modell, um Wirt-Parasiten-Wechselwirkungen zu studieren10, hat aber auch viele andere Anwendungen. Zum Beispiel erfordern die aktuellen Methoden zur Auswahl und Verbreitung genetisch veränderter Cryptosporidium-Parasiten die Durchfahrt in Mäuse19, die keine Isolierung von Parasiten zulässt, die für eine In-vivo-Infektion wesentliche Modifikationen aufweisen. Organoi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Deborah A. Schaefer von der School of Animal and Comparative Biomedical Sciences, College of Agriculture and Life Sciences, University of Arizona, Tucson, AZ, USA, dass sie uns bei der Herstellung und Analyse von Oozysten geholfen hat. Wir danken auch Franceschi Microscopy and Imaging Center und D.L. Mullendore an der Washington State University für die TEM-Vorbereitung und Bildgebung von isolierten organoiden Oozysten.
D.D. erhält ein VENI-Stipendium der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO-ALW, 016.Veni.171.015). I.H. erhält ein VENI-Stipendium der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO-ALW, 863.14.002) und wurde von Marie-Curie-Stipendien der Europäischen Kommission unterstützt (Vorschlag 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). Die Zu diesen Ergebnissen führenden Forschungsarbeiten wurden vom Europäischen Forschungsrat im Rahmen des ERC Advanced Grant Agreement Nr. 67013 und des NIH NIAIH unter R21 AT009174 bis RMO gefördert. Diese Arbeit ist Teil des Oncode-Instituts, das zum Teil von der Niederländischen Krebsgesellschaft finanziert und durch ein Stipendium der Niederländischen Krebsgesellschaft finanziert wurde.
Materials
| Basement membrane extract (extracellular matrix) | amsbio | 3533-010-02 | |
| Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody) | Waterborne, Inc | A400FLR-1X | Final Concentration = Use 2-3 drops/slide |
| Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads | Waterborne, Inc | IMS400-20 | |
| Dynamag 15 rack | Thermofisher Scientific | 12301D | |
| Dynamag 2 rack | Thermofisher Scientific | 12321D | |
| EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µm | EMD-Millipore | TSTP02500 | |
| Fast green dye | SIGMA | F7252-5G | |
| Femtojet 4i Microinjector | Eppendorf | 5252000013 | |
| Glass capillaries of 1 mm diameter | WPI | TW100F-4 | |
| Matrigel (extracellular matrix) | Corning | 356237 | |
| Microfuge tube 1.5ml | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Micro-loader tips | Eppendorf | 612-7933 | |
| Micropipette puller P-97 | Shutter instrument | P-97 | |
| Normal donkey Serum | Bio-Rad | C06SB | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium hypoclorite (use 5%) | Clorox | 50371478 | |
| Super stick slides | Waterborne, Inc | S100-3 | |
| Swinnex-25 47mm Polycarbonate filter holder | EMD-Millipore | SX0002500 | |
| Taurocholic acid sodium salt hydrate | SIGMA | T4009-5G | |
| Tween-20 | Merck | 8221840500 | |
| Vectashield mounting agent | Vector Labs | H-1000 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries, Inc | SI0236 | |
| Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes) | Final amount | ||
| DMEM | Invitrogen | 12634-010 | 500ml |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| Glutamax | Gibco | 35050038 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| Hepes | Gibco | 15630056 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media) | Final concentration | ||
| A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 0.5µM |
| Adv+++ | make upto 100 ml | ||
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 1X |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50ng/mL |
| Gastrin | Tocris | 3006-1mg | 10 nM |
| NAC | Sigma | A9125-25G | 1.25mM |
| NIC | Sigma | N0636-100G | 10mM |
| Noggin CM | In house* | 10% | |
| P38 inhibitor (SB202190) | Sigma | S7076-25 mg | 10µM |
| PGE2 | Tocris | 2296/10 | 10 nM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1ml/500ml media |
| RSpoI CM | In house* | 20% | |
| Wnt3a CM | In house* | 50% | |
| In house* – cell lines will be provided upon request | |||
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media) | To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME) | ||
| LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media) | Final concentration | ||
| Adv+++ | make upto 100 ml | ||
| ALK-I A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 500nM |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 0.0763888889 |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100ng/ml |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 25ng/ml |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9125-25G | 1.25mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 5mM |
| Noggin UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| p38 MAPK-I | Sigma | S7076-25 mg | 1µM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1:500 |
| RhoKI Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817_100 mg | 2.5µm |
| Rspo UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection) | Final concentration | ||
| L-Glutathione reduced | Sigma | G4251-10MG | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Betaine | Sigma | 61962 | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| L-Cysteine | Sigma | 168149-2.5G | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Linoleic acid | Sigma | L1376-10MG | 6.8 μg/ml of OME/OMD /LOM |
| Taurine | Sigma | T0625-10MG | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Blocking buffer (for immunoflourescence staining) | Final concentration | ||
| Donkey/Goat serum | Bio-Rad | C06SB | 2% |
| PBS | Thermo-Fisher | 70011044 | Make upto 100ml |
| Tween 20 | Merck | P1379 | 0.1% |
| List of Antibodies used | |||
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Invitrogen | A-11011 | Dilution-1:500; RRID: AB_143157 |
| Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo | Waterborne, Inc | A400FLK | Dilution- 1:200 |
| Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive | Waterborne, Inc | IMS400-20 | Dilution-1:500 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Dilution-1:1000; RRID : AB_2629482 |
| Phalloidin-Alexa 674 | Invitrogen | A22287 | Dilution-1:1000; RRID: AB_2620155 |
| Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author). | Upon request | Upon request | Dilution-1:500 |
| Sporo-Glo | Waterborne, Inc | A600FLR-1X | Dilution- 1:200 |
References
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