לימוד זיהום הצפנה ברקמה תלת-ממדית-מערכות תרבות מיקרואיד של האדם הנגזר על ידי מיקרו-הזרקה
Summary
אנו מתארים פרוטוקולים כדי להכין זיהומים ולטהר את הנבגים עבור לימוד זיהום של המעי האנושי ואורגאואידים על ידי הקריפטוספורידיום parvum. אנו מדגימים את ההליכים למיקרו הזרקה של טפילים לתוך מעיים אורגנואיד וכתמים של אורגנואידים. לבסוף, אנו מתארים את הבידוד. של ציסטות שנוצרו מהאורגנואידים
Abstract
קריפטוספורידיום parvum הוא אחד הגורמים העיקריים של מחלת diarrheal אנושי. כדי להבין את הפתולוגיה של הטפיל ולפתח תרופות יעילות, מערכת תרבות מבחנה המהווה את התנאים במארח יש צורך. אורגנואידים, הדומה מאוד לרקמות המוצא שלהם, הם אידיאליים ללימוד אינטראקציות מארחים-פרזיאליות. אורגנואידים הם תלת-ממדיים (3D) מבנים מבוססי רקמה הנגזרים מתאי גזע בוגרים וגדלים בתרבות לפרקי זמן ארוכים מבלי לעבור סטייה גנטית או טרנספורמציה. יש להם קוטביות מוגדרת היטב עם משטחי פסגה וגם בזלת צלעות. אורגנואידים יש יישומים שונים בדיקות סמים, ביו בנקאות, ומידול מחלות ומארח-חיידק אינטראקציה לימודים. כאן אנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד של איך להכין את הנבגים ואת הספוראוזוטים של קריפטוספורידיום לזיהום המעי האנושי אורגנואידים. אנו לאחר מכן להדגים כיצד מיקרוהזרקה ניתן להשתמש כדי להזריק את החיידקים לתוך אורגאיד לומן. ישנן שלוש שיטות עיקריות שבהן ניתן להשתמש באורגנואידים למחקרים מארחים-חיידק-מיקרוהזרקה, הטיה מכנית וציפוי, ועל ידי ביצוע monolayers. מיקרוהזרקה מאפשרת תחזוקה של המבנה התלת-ממדי ומאפשרת שליטה מדויקת באמצעי הטפיל והמגע הישיר הרשמי של החיידקים. אנו מספקים פרטים עבור צמיחה אופטימלית של אורגנואידים עבור הדמיה או הייצור הoocyst. בסופו של דבר, אנו גם להדגים כיצד אאוציסטות שנוצר לאחרונה ניתן מבודד אורגאיד עבור המשך עיבוד וניתוח במורד הזרם.
Introduction
התפתחות של תרופות או חיסונים לטיפול ומניעה של הדבקת הצפנה היתה מעכבת היעדר מערכות מבחנה אשר לחקות בדיוק את המצב vivo בבני אדם1,2. רבים מהמערכות הזמינות כעת רק לאפשר זיהום לטווח קצר (< 5 ימים) או לא לתמוך במחזור החיים המלא של הטפיל3,4. מערכות אחרות המאפשרות התפתחות מלאה של הטפיל מבוססים על קווי תאים מונצח או תאים סרטניים שאינם בנאמנות המצב הפיזיולוגי של בני אדם5,6,7 . אורגנואידים או ‘ מיני איברי ‘ הם 3D רקמות נגזרות מבנים אשר גדלים במטריצה מתוך החילוץ שנוספו עם רקמות שונות מסוימים הצמיחה גורמים. אורגנואידים פותחו מאיברים שונים ורקמות. הם יציבים מבחינה גנטית ומוארכים את רוב התפקודים של אברי המוצא שלהם, ויכולים להישמר בתרבות לפרקי זמן ארוכים. פיתחנו שיטה לזיהום המעי האנושי והריאות אורגנואידים עם Cryptosporidium המספקת מודל מדויק של מבחנה למחקר של אינטראקציות מארח טפיל רלוונטי מעיים והצפנת הנשימה8 ,9,10,11,12,13. בניגוד לדגמים אחרים של תרבות שפורסמו, מערכת האורגנואיד מייצגת אינטראקציות טפיל מארח של החיים האמיתיים, מאפשרת השלמת מחזור החיים כך שכל השלבים של מחזור החיים הטפיל ניתן ללמוד, ושומר על התפשטות הטפיל עד 28 ימים10.
Cryptosporidium parvum הוא טפיל apicom, אשר מדביק את האפיתל של הנשימה ומעיים שדות, גרימת מחלה diarrheal ממושכת. השלב הסביבתי עמיד הוא oocyst, נמצא מזון מזוהם מים14. לאחר שבלע או שאפה, את הריזוטו ומשחרר ארבעה sporozoites כי לצרף לתאי אפיתל. Sporozoites להחליק על תאים מארחים ולעסוק קולטנים תא מארח, אבל הטפיל לא לפלוש באופן מלא לתא, והוא מופיע כדי לגרום לתא המארח להפרץ15. הטפיל, שהופנמו בתוך תא פנימי, אך ממוכך, נשאר על פני השטח הרשמי של התא, ומשכפל בתוך החללים הפרזיטואטיים. הוא עובר שני סיבובים של רבייה לא-מינית – תהליך הנקרא merogony. במהלך המראווני, הסוג שאני מפתח מפתחים אשר מכילים שמונה merozoites המשוחררים לפלוש לתאים חדשים. אלה merozoites לפלוש תאים חדשים כדי להתפתח סוג II meronts המכיל ארבעה merozoites. Merozoites אלה, כאשר הם משתחררים, להדביק תאים ולהתפתח מאקרוגמונטים ומיקרוגמבטים. מיקרוגיים משתחררים ומדשן את המקגיים המייצרים זיטים שבוגרים לתוך ציסטות. בוגרת האוציסטות משתחררים לאחר מכן לתוך לומן. האוציסטות הן דקות-חומה אשר מיד מייבאות להדביק את האפיתל, או מוקף חומה עבה אשר משתחררים לתוך הסביבה כדי להדביק את המארח הבא14. כל שלבי הצפנת מחזור החיים זוהו במערכת התרבות האורגאידית שפותחה בעבר על ידי הקבוצה שלנו10.
מאז בנאמנות האדם אורגנואידים שכפול רקמות האדם9,11,13, ותמיכה בכל השלבים replicative הצפנה10, הם מערכת התרבות האידיאלית רקמה ללמוד קריפטוספטורידיום ביולוגיה ואינטראקציות מארחים-טפיל. כאן אנו מתארים את ההליכים לזיהום אורגנואידים עם שני ציסטות קריפטוגנטים ו-הצפנה , ובידוד החדש אאוציסטות המיוצר במערכת זו תרבות רקמה.
Protocol
Representative Results
Discussion
תרבות של הצפנת הצפנה טפילים במעי ואורגנואידים הנשימה מספק מודל מדויק ללמוד אינטראקציות מארח טפיל10 אבל יש גם יישומים רבים אחרים. לדוגמה, השיטות הנוכחיות של בחירת והפצת הצפנה מהונדסים גנטית טפילים דורשים מעבר בעכברים19 אשר אינו מאפשר בידוד של טפילים כי י?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה לדבורה א. שפר מבית הספר של בעלי חיים ומדעי ביורפואי השוואתי, המכללה לחקלאות ומדעי החיים, אוניברסיטת אריזונה, טוסון, AZ, ארה ב על שסייע לנו עם ייצור וניתוח הoocyst. כמו כן, אנו מודים לגבי מיקרוסקופ ומרכז ההדמיה ו-d. d Mullendore באוניברסיטת וושינגטון לקראת הכנה והדמיה של ציסטות מבודדות של אורגנואיד.
D.D. הוא המקבל של מענק בני מארגון הולנד למחקר מדעי (NWO-ALW, 016.171.015). I.H. הוא המקבל של מענק בני מארגון הולנד למחקר מדעי (NWO-ALW, 863.14.002) ונתמך על ידי מלגות מארי קירי מהוועדה האירופית (הצעה 330571 FP7-אנשים-2012-IIF). המחקר המוביל לתוצאות אלה קיבל מימון ממועצת המחקר האירופית תחת הסכם מתקדם המענק של ERC no. 67013 ו-NIH NIAIH תחת R21 AT009174 כדי RMO. עבודה זו היא חלק ממכון Oncode, אשר ממומן חלקית על ידי האגודה ההולנדית לסרטן ומומן על ידי מענק של האגודה ההולנדית לסרטן.
Materials
| Basement membrane extract (extracellular matrix) | amsbio | 3533-010-02 | |
| Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody) | Waterborne, Inc | A400FLR-1X | Final Concentration = Use 2-3 drops/slide |
| Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads | Waterborne, Inc | IMS400-20 | |
| Dynamag 15 rack | Thermofisher Scientific | 12301D | |
| Dynamag 2 rack | Thermofisher Scientific | 12321D | |
| EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µm | EMD-Millipore | TSTP02500 | |
| Fast green dye | SIGMA | F7252-5G | |
| Femtojet 4i Microinjector | Eppendorf | 5252000013 | |
| Glass capillaries of 1 mm diameter | WPI | TW100F-4 | |
| Matrigel (extracellular matrix) | Corning | 356237 | |
| Microfuge tube 1.5ml | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Micro-loader tips | Eppendorf | 612-7933 | |
| Micropipette puller P-97 | Shutter instrument | P-97 | |
| Normal donkey Serum | Bio-Rad | C06SB | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium hypoclorite (use 5%) | Clorox | 50371478 | |
| Super stick slides | Waterborne, Inc | S100-3 | |
| Swinnex-25 47mm Polycarbonate filter holder | EMD-Millipore | SX0002500 | |
| Taurocholic acid sodium salt hydrate | SIGMA | T4009-5G | |
| Tween-20 | Merck | 8221840500 | |
| Vectashield mounting agent | Vector Labs | H-1000 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries, Inc | SI0236 | |
| Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes) | Final amount | ||
| DMEM | Invitrogen | 12634-010 | 500ml |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| Glutamax | Gibco | 35050038 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| Hepes | Gibco | 15630056 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media) | Final concentration | ||
| A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 0.5µM |
| Adv+++ | make upto 100 ml | ||
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 1X |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50ng/mL |
| Gastrin | Tocris | 3006-1mg | 10 nM |
| NAC | Sigma | A9125-25G | 1.25mM |
| NIC | Sigma | N0636-100G | 10mM |
| Noggin CM | In house* | 10% | |
| P38 inhibitor (SB202190) | Sigma | S7076-25 mg | 10µM |
| PGE2 | Tocris | 2296/10 | 10 nM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1ml/500ml media |
| RSpoI CM | In house* | 20% | |
| Wnt3a CM | In house* | 50% | |
| In house* – cell lines will be provided upon request | |||
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media) | To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME) | ||
| LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media) | Final concentration | ||
| Adv+++ | make upto 100 ml | ||
| ALK-I A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 500nM |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 0.0763888889 |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100ng/ml |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 25ng/ml |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9125-25G | 1.25mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 5mM |
| Noggin UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| p38 MAPK-I | Sigma | S7076-25 mg | 1µM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1:500 |
| RhoKI Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817_100 mg | 2.5µm |
| Rspo UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection) | Final concentration | ||
| L-Glutathione reduced | Sigma | G4251-10MG | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Betaine | Sigma | 61962 | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| L-Cysteine | Sigma | 168149-2.5G | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Linoleic acid | Sigma | L1376-10MG | 6.8 μg/ml of OME/OMD /LOM |
| Taurine | Sigma | T0625-10MG | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Blocking buffer (for immunoflourescence staining) | Final concentration | ||
| Donkey/Goat serum | Bio-Rad | C06SB | 2% |
| PBS | Thermo-Fisher | 70011044 | Make upto 100ml |
| Tween 20 | Merck | P1379 | 0.1% |
| List of Antibodies used | |||
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Invitrogen | A-11011 | Dilution-1:500; RRID: AB_143157 |
| Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo | Waterborne, Inc | A400FLK | Dilution- 1:200 |
| Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive | Waterborne, Inc | IMS400-20 | Dilution-1:500 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Dilution-1:1000; RRID : AB_2629482 |
| Phalloidin-Alexa 674 | Invitrogen | A22287 | Dilution-1:1000; RRID: AB_2620155 |
| Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author). | Upon request | Upon request | Dilution-1:500 |
| Sporo-Glo | Waterborne, Inc | A600FLR-1X | Dilution- 1:200 |
References
- Checkley, W., et al. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium. The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).
- Bones, A. J., et al. Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research. Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).
- Muller, J., Hemphill, A. In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals. International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).
- Karanis, P., Aldeyarbi, H. M. Evolution of Cryptosporidium in vitro culture. International Journal for Parasitology. 41 (12), 1231-1242 (2011).
- Morada, M., et al. Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology. International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).
- DeCicco RePass, M. A., et al. Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum. Infection and Immunity. 85 (3), (2017).
- Miller, C. N., et al. A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology. International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modelling. bioRxiv. , (2018).
- Dutta, D., Clevers, H. Organoid culture systems to study host-pathogen interactions. Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- O’Hara, S. P., Chen, X. M. The cell biology of Cryptosporidium infection. Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).
- Lendner, M., Daugschies, A. Cryptosporidium infections: molecular advances. Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).
- Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells. Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).
- O’Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens. Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).
- Wilke, G., et al. Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro. mSphere. 3 (3), (2018).
- Vinayak, S., et al. Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum. Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
