Het bestuderen van Cryptosporidium infectie in 3D-weefsel-afgeleide menselijke Organoid cultuur systemen door Microinjection
Summary
We beschrijven protocollen voor het bereiden van oöcysten en zuiveren sporozoieten voor het bestuderen van infectie van menselijke intestinale en luchtweg organoïden door Cryptosporidium parvum. We demonstreren de procedures voor micro injectie van parasieten in het intestinale organoïde lumen en immunokleuring van organoïden. Tot slot beschrijven we de isolatie van gegenereerde oöcysten uit de organoïden.
Abstract
Cryptosporidium parvum is een van de belangrijkste oorzaken van de ziekte van de mens diarree. Om de pathologie van de parasiet te begrijpen en efficiënte geneesmiddelen te ontwikkelen, is een in vitro cultuur systeem dat de omstandigheden in de gastheer recapitates nodig. Organoïden, die sterk lijken op de weefsels van hun oorsprong, zijn ideaal voor het bestuderen van interacties tussen gastheer en parasiet. Organoïden zijn driedimensionale (3D) weefselstructuren die zijn afgeleid van adulte stamcellen en die gedurende langere tijd in cultuur groeien zonder genetische afwijkingen of transformatie te ondergaan. Ze hebben een goed gedefinieerde polariteit met zowel apicale als basolaterale oppervlakken. Organoïden hebben verschillende toepassingen in drug testing, bio Banking, en ziekte modellering en host-microbe interactiestudies. Hier presenteren we een stap-voor-stap Protocol van hoe de oöcysten en sporozoïeten van Cryptosporidium voor het infecteren van de menselijke intestinale en luchtweg organoïden voor te bereiden. Vervolgens laten we zien hoe micro-injectie kan worden gebruikt om de microben in de organoïde lumen te injecteren. Er zijn drie belangrijke methoden waarmee organoïden kunnen worden gebruikt voor host-microbe interactiestudies — micro Injection, mechanisch scheren en beplating, en door het maken van monolayers. Micro Injection maakt onderhoud van de 3D-structuur mogelijk en zorgt voor nauwkeurige controle van de parasiet volumes en direct apicaal zijcontact voor de microben. We bieden Details voor een optimale groei van organoïden voor Imaging of oocyste productie. Ten slotte tonen we ook aan hoe de nieuw gegenereerde oöcysten kunnen worden geïsoleerd van de organoïde voor verdere downstream verwerking en analyse.
Introduction
Ontwikkeling van geneesmiddelen of vaccins voor de behandeling en preventie van Cryptosporidium infectie is belemmerd door het ontbreken van in-vitro systemen die de in vivo situatie bij de mens nauwkeurig nabootsen1,2. Veel van de momenteel beschikbare systemen alleen toestaan korte termijn infectie (< 5 dagen) of bieden geen ondersteuning voor de volledige levenscyclus van de parasiet3,4. Andere systemen die de volledige ontwikkeling van de parasiet mogelijk maken, zijn gebaseerd op vereeuwigd cellijnen of cellijnen van kanker die de fysiologische situatie bij de mens niet getrouw recapituleren5,6,7 . Organoïden of ‘ mini-orgels ‘ zijn 3D-weefsel afgeleide structuren die worden gekweekt in een extracellulaire matrix aangevuld met verschillende weefsel specifieke groeifactoren. Organoïden zijn ontwikkeld uit verschillende organen en weefsels. Ze zijn genetisch stabiel en recapituleren de meeste functies van de organen van hun oorsprong en kunnen gedurende langere tijd in cultuur worden gehouden. We hebben een methode ontwikkeld voor het infecteren van humane intestinale en Long organoïden met Cryptosporidium dat een nauwkeurig in vitro model biedt voor de studie van gastheer-parasiet interacties die relevant zijn voor intestinale en respiratoire Cryptosporidiose8 ,9,10,11,12,13. In tegenstelling tot andere gepubliceerde cultuur modellen, het organoïde systeem is representatief voor Real-Life host parasiet interacties, maakt het mogelijk voor de voltooiing van de levenscyclus, zodat alle stadia van de parasiet levenscyclus kan worden bestudeerd, en onderhoudt parasiet propagatie tot 28 dagen10.
Cryptosporidium parvum is een apicomplexaanse parasiet die het epitheel van de Ademhalings-en darm tracten infecteert, waardoor een langdurige diarree ziekte ontstaat. De resistente milieu fase is de oocyste, gevonden in verontreinigd voedsel en water14. Eenmaal geconsumeerd of geïnhaleerd, de oocyste excysts en releases vier sporozoieten die hechten aan epitheliale cellen. Sporozoites glijden op hosts cellen en Engage host cel receptoren, maar de parasiet niet volledig de cel binnenvallen, en lijkt te induceren van de host cel om het te verzwelgen15. De parasiet, die binnen een intracellulair maar extracytoplasmisch compartiment geïnternationaliseerd is, blijft op het apicale oppervlak van de cel, repliceert binnen een parasitophoreuze vacuole. Het ondergaat twee ronden ongeslachtelijke voortplanting — een proces dat merogony wordt genoemd. Tijdens merogony ontwikkelen type I meronts die acht merozoïeten bevatten die vrijkomen om nieuwe cellen binnen te dringen. Deze merozoïeten binnenvallen nieuwe cellen te ontwikkelen tot type II meronts met vier merozoïeten. Deze merozoites, wanneer vrijgegeven, infecteren cellen en ontwikkelen tot macrogamonts en microgamonts. Microgameten worden vrijgegeven en bevruchten de macrogameten die zygoten produceren, die volwassen worden tot oöcysten. Volwassen oöcysten worden vervolgens in het lumen vrijgegeven. Oöcysten zijn ofwel dun-ommuurd die onmiddellijk excyst om het epitheel te reinfecteren, of dikke ommuurde die vrijkomen in het milieu om de volgende gastheer14infecteren. Alle stadia van de levenscyclus van Cryptosporidium zijn geïdentificeerd in het organoïde cultuur systeem dat eerder werd ontwikkeld door onze groep10.
Omdat menselijke organoïden getrouw de menselijke weefsels9,11,13nabootsen en alle replicatieve stadia van Cryptosporidium10ondersteunen, zijn ze het ideale weefselkweek systeem om te bestuderen Cryptosporidium biologie en gastheer-parasiet interacties. Hier beschrijven we de procedures voor het infecteren van organoïden met zowel Cryptosporidium oöcysten en excysted sporozoites, en het isoleren van de nieuwe oöcysten geproduceerd in dit weefselcultuur systeem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cultuur van Cryptosporidium parasieten in intestinale en luchtweg organoïden biedt een nauwkeurig model om gastheer-parasiet interacties10 te bestuderen, maar heeft ook veel andere toepassingen. De huidige methoden voor het selecteren en propageren van genetisch gemodificeerde Cryptosporidium parasieten vereisen bijvoorbeeld passage in muizen19 die geen isolatie van parasieten mogelijk maakt die modificaties hebben die essentieel zijn voor in-vivo-infecti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn Deborah A. Schaefer dankbaar van de school voor dier-en vergelijkende Biomedische Wetenschappen, het College voor landbouw en levenswetenschappen, de Universiteit van Arizona, Tucson, AZ, USA om ons te helpen met de productie en analyse van oocyste. We danken ook Franceschi Microscopy en Imaging Center en D.L. Mullendore aan de Washington State University voor tem-voorbereiding en beeldvorming van geïsoleerde organoïde-oöcysten.
D.D. is de ontvanger van een VENI-beurs van de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO-ALW, 016. Veni. 171.015). I.H. is de ontvanger van een VENI-subsidie van de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO-ALW, 863.14.002) en werd gesteund door de Marie Curie-beurzen van de Europese Commissie (voorstel 330571 KP7-PEOPLE-2012-IIF). Het onderzoek dat tot deze resultaten heeft geleid, heeft financiering ontvangen van de Europese Onderzoeksraad onder ERC Advanced subsidie Agreement No. 67013 en van NIH NIAIH onder R21 AT009174 naar RMO. Dit werk maakt deel uit van het Oncode Institute, dat deels wordt gefinancierd door de Nederlandse Kankervereniging en werd gefinancierd door een subsidie van de Nederlandse Kankervereniging.
Materials
| Basement membrane extract (extracellular matrix) | amsbio | 3533-010-02 | |
| Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody) | Waterborne, Inc | A400FLR-1X | Final Concentration = Use 2-3 drops/slide |
| Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads | Waterborne, Inc | IMS400-20 | |
| Dynamag 15 rack | Thermofisher Scientific | 12301D | |
| Dynamag 2 rack | Thermofisher Scientific | 12321D | |
| EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µm | EMD-Millipore | TSTP02500 | |
| Fast green dye | SIGMA | F7252-5G | |
| Femtojet 4i Microinjector | Eppendorf | 5252000013 | |
| Glass capillaries of 1 mm diameter | WPI | TW100F-4 | |
| Matrigel (extracellular matrix) | Corning | 356237 | |
| Microfuge tube 1.5ml | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Micro-loader tips | Eppendorf | 612-7933 | |
| Micropipette puller P-97 | Shutter instrument | P-97 | |
| Normal donkey Serum | Bio-Rad | C06SB | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium hypoclorite (use 5%) | Clorox | 50371478 | |
| Super stick slides | Waterborne, Inc | S100-3 | |
| Swinnex-25 47mm Polycarbonate filter holder | EMD-Millipore | SX0002500 | |
| Taurocholic acid sodium salt hydrate | SIGMA | T4009-5G | |
| Tween-20 | Merck | 8221840500 | |
| Vectashield mounting agent | Vector Labs | H-1000 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries, Inc | SI0236 | |
| Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes) | Final amount | ||
| DMEM | Invitrogen | 12634-010 | 500ml |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| Glutamax | Gibco | 35050038 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| Hepes | Gibco | 15630056 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media) | Final concentration | ||
| A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 0.5µM |
| Adv+++ | make upto 100 ml | ||
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 1X |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50ng/mL |
| Gastrin | Tocris | 3006-1mg | 10 nM |
| NAC | Sigma | A9125-25G | 1.25mM |
| NIC | Sigma | N0636-100G | 10mM |
| Noggin CM | In house* | 10% | |
| P38 inhibitor (SB202190) | Sigma | S7076-25 mg | 10µM |
| PGE2 | Tocris | 2296/10 | 10 nM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1ml/500ml media |
| RSpoI CM | In house* | 20% | |
| Wnt3a CM | In house* | 50% | |
| In house* – cell lines will be provided upon request | |||
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media) | To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME) | ||
| LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media) | Final concentration | ||
| Adv+++ | make upto 100 ml | ||
| ALK-I A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 500nM |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 0.0763888889 |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100ng/ml |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 25ng/ml |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9125-25G | 1.25mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 5mM |
| Noggin UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| p38 MAPK-I | Sigma | S7076-25 mg | 1µM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1:500 |
| RhoKI Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817_100 mg | 2.5µm |
| Rspo UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection) | Final concentration | ||
| L-Glutathione reduced | Sigma | G4251-10MG | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Betaine | Sigma | 61962 | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| L-Cysteine | Sigma | 168149-2.5G | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Linoleic acid | Sigma | L1376-10MG | 6.8 μg/ml of OME/OMD /LOM |
| Taurine | Sigma | T0625-10MG | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Blocking buffer (for immunoflourescence staining) | Final concentration | ||
| Donkey/Goat serum | Bio-Rad | C06SB | 2% |
| PBS | Thermo-Fisher | 70011044 | Make upto 100ml |
| Tween 20 | Merck | P1379 | 0.1% |
| List of Antibodies used | |||
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Invitrogen | A-11011 | Dilution-1:500; RRID: AB_143157 |
| Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo | Waterborne, Inc | A400FLK | Dilution- 1:200 |
| Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive | Waterborne, Inc | IMS400-20 | Dilution-1:500 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Dilution-1:1000; RRID : AB_2629482 |
| Phalloidin-Alexa 674 | Invitrogen | A22287 | Dilution-1:1000; RRID: AB_2620155 |
| Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author). | Upon request | Upon request | Dilution-1:500 |
| Sporo-Glo | Waterborne, Inc | A600FLR-1X | Dilution- 1:200 |
References
- Checkley, W., et al. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium. The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).
- Bones, A. J., et al. Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research. Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).
- Muller, J., Hemphill, A. In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals. International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).
- Karanis, P., Aldeyarbi, H. M. Evolution of Cryptosporidium in vitro culture. International Journal for Parasitology. 41 (12), 1231-1242 (2011).
- Morada, M., et al. Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology. International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).
- DeCicco RePass, M. A., et al. Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum. Infection and Immunity. 85 (3), (2017).
- Miller, C. N., et al. A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology. International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modelling. bioRxiv. , (2018).
- Dutta, D., Clevers, H. Organoid culture systems to study host-pathogen interactions. Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- O’Hara, S. P., Chen, X. M. The cell biology of Cryptosporidium infection. Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).
- Lendner, M., Daugschies, A. Cryptosporidium infections: molecular advances. Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).
- Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells. Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).
- O’Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens. Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).
- Wilke, G., et al. Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro. mSphere. 3 (3), (2018).
- Vinayak, S., et al. Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum. Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
