マイクロインジェクションによる3D組織由来ヒトオルガノイド培養システムにおけるクリプトスポリジウム感染の研究
Summary
我々は、クリプトスポリジウムパルバムによるヒト腸および気道オルガノイドの感染を研究するための卵胞を調造し、スポロゾイツを精製するためのプロトコルを説明する。腸内臓器内膜への寄生虫のマイクロインジェクションとオルガノイドの免疫染色の手順を示す.最後に、オルガノイドから発生した卵胞の単離について述べた。
Abstract
クリプトスポリジウムパルバムは、ヒト下痢症の主な原因の一つである。寄生虫の病理を理解し、効率的な薬剤を開発するためには、宿主の状態を要約するインビトロ培養システムが必要である。オルガノイドは、その起源の組織によく似ており、宿主と寄生虫の相互作用を研究するのに理想的です。オルガノイドは、成体幹細胞に由来し、遺伝的収差や形質転換を受けることなく長期間培養中に増殖する三次元(3D)組織由来構造である。それらは頂点および浴盤の表面との極性をよく定義した。オルガノイドは、薬物検査、バイオバンキング、疾患モデリングおよび宿主微生物相互作用研究において様々な用途を有する。ここでは、ヒトの腸および気道オルガノイドに感染するためのクリプトスポリジウムの卵胞およびスポロゾイツを調製する方法のステップバイステップのプロトコルを提示する。次に、マイクロインジェクションを使用して微生物をオルガノイド内膜に注入する方法を示します。オルガノイドを宿主微生物相互作用研究に使用できる主な方法は、マイクロインジェクション、機械的せん断、めっき、単層の作り方の3つがあります。マイクロインジェクションは3D構造の維持を可能にし、寄生虫の容積および微生物のための直接頂点の側面接触の精密な制御を可能にする。イメージングまたは卵嚢胞産生のためのオルガノイドの最適な成長のための詳細を提供します。最後に、新たに生成された卵胞をオルガノイドから単離して、さらに下流の処理と解析を行う方法も示します。
Introduction
クリプトスポリジウム感染の治療および予防のための薬剤またはワクチンの開発は、ヒト1,2における生体内状況を正確に模倣するインビトロシステムの欠如によって妨げられている。現在利用可能なシステムの多くは、短期的な感染(<5日)のみを許可するか、寄生虫3、4の完全なライフサイクルをサポートしていません。寄生虫の完全な発達を可能にする他のシステムは、ヒトの生理状況を忠実に要約しない不死化細胞株または癌細胞株に基づいている5,6,7.オルガノイドまたは「ミニ臓器」は、様々な組織特異的成長因子を補完する細胞外マトリックスで成長する3D組織由来の構造である。オルガノイドは、様々な臓器や組織から開発されています。それらは遺伝的に安定しており、その起源の器官のほとんどの機能を要約し、長期間培養中に維持することができる。腸と呼吸器クリプトスポリジウムに関連する宿主寄生虫相互作用の研究のための正確なインビトロモデルを提供するクリプトスポリジウムでヒトの腸および肺オルガノイドを感染させる方法を開発した8 ,9,10,11,12,13.他の公表された培養モデルとは対照的に、オルガノイド系は、実際の宿主寄生虫相互作用を代表し、寄生虫のライフサイクルのすべての段階を研究できるようにライフサイクルを完了し、寄生虫の伝播を維持することができます。最大28日間10.
クリプトスポリジウムパルバムは、呼吸器および腸管の上皮に感染し、長期の下痢疾患を引き起こすアピコンプレミカン寄生虫である。耐性環境段階は、汚染された食品および水14に見られる卵胞である。一度摂取または吸入すると、卵嚢胞は上皮細胞に付着する4つのスポロゾイトを放出する。スポロゾイテスは宿主細胞上を滑走し、宿主細胞受容体を従事させるが、寄生虫は細胞に完全に侵入せず、宿主細胞を誘発して15を巻き込むように見える。寄生虫は、細胞内の内部に内在するが、細胞外のクラスタ内に残り、細胞の頂点に残り、寄生虫の真空中で複製する。それは無性生殖の2ラウンドを受ける – メロゴニーと呼ばれるプロセス。メロゴンの間に、新しい細胞に侵入するために放出される8つのメロゾイトを含むI型メロンが発達する。これらのメロゾイトは新しい細胞に侵入し、4つのメロゾイトを含むII型メロンに発展する。これらのメロゾサイトは、放出されると、細胞に感染し、マクロガモントおよびマイクロガモントに発症する。マイクロガメテスが放出され、成熟したザイゴットを産生するマクロガメテスを受精させる。成熟した卵胞は、その後内膜に放出される。卵嚢胞は、上皮を再感染させる直ちに排泄物を放出する薄い壁であるか、または次の宿主14に感染するために環境に放出される厚い壁である。クリプトスポリジウムライフサイクルのすべての段階は、我々のグループ10によって以前に開発されたオルガノイド培養システムで同定されている。
ヒトオルガノイドはヒト組織9、11、13を忠実に複製し、クリプトスポリジウム10のすべての複製段階をサポートするので、それらは研究する理想的な組織培養システムであるクリプトスポリジウム生物学と宿主寄生虫相互作用ここでは、クリプトスポリジウム卵胞子と排泄されたスポロゾイツの両方でオルガノイドに感染し、この組織培養システムで産生される新しい卵胞を分離する手順について説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
腸および気道オルガノイドにおけるクリプトスポリジウム寄生虫の培養は、宿主寄生虫相互作用10を研究するための正確なモデルを提供するが、他にも多くの用途を有する。例えば、遺伝子組み換えクリプトスポリジウム寄生虫を選択して伝播する現在の方法は、生体内感染に不可欠な改変を有する寄生虫の単離を許可しないマウス19の通過を…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
アリゾナ大学ツーソン校(アリゾナ州)の動物比較生物医学部のデボラ・A・シェーファー氏に感謝しています。我々はまた、孤立したオルガノイド卵胞のTEM調製およびイメージングのためにワシントン州立大学のフランチェスキ顕微鏡・画像センターとD.L.マレンドーアに感謝する。
D.D.は、オランダ科学研究機構(NWO-ALW, 016.Veni.171.015)からのVENI助成金の受領者です。I.H.は、オランダ科学研究機構(NWO-ALW,863.14.002)からのVENI助成金の受領者であり、欧州委員会(提案330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF)のマリー・キュリー・フェローシップによって支援されました。これらの結果につながる研究は、ERCアドバンスト補助金契約第67013号の欧州研究評議会から、およびR21 AT009174の下でNIH NIAIHからRMOに資金を受けています。この研究は、オランダ癌協会の一部が資金提供を受け、オランダ癌協会の助成金を受けたOncode研究所の一部です。
Materials
| Basement membrane extract (extracellular matrix) | amsbio | 3533-010-02 | |
| Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody) | Waterborne, Inc | A400FLR-1X | Final Concentration = Use 2-3 drops/slide |
| Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads | Waterborne, Inc | IMS400-20 | |
| Dynamag 15 rack | Thermofisher Scientific | 12301D | |
| Dynamag 2 rack | Thermofisher Scientific | 12321D | |
| EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µm | EMD-Millipore | TSTP02500 | |
| Fast green dye | SIGMA | F7252-5G | |
| Femtojet 4i Microinjector | Eppendorf | 5252000013 | |
| Glass capillaries of 1 mm diameter | WPI | TW100F-4 | |
| Matrigel (extracellular matrix) | Corning | 356237 | |
| Microfuge tube 1.5ml | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Micro-loader tips | Eppendorf | 612-7933 | |
| Micropipette puller P-97 | Shutter instrument | P-97 | |
| Normal donkey Serum | Bio-Rad | C06SB | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium hypoclorite (use 5%) | Clorox | 50371478 | |
| Super stick slides | Waterborne, Inc | S100-3 | |
| Swinnex-25 47mm Polycarbonate filter holder | EMD-Millipore | SX0002500 | |
| Taurocholic acid sodium salt hydrate | SIGMA | T4009-5G | |
| Tween-20 | Merck | 8221840500 | |
| Vectashield mounting agent | Vector Labs | H-1000 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries, Inc | SI0236 | |
| Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes) | Final amount | ||
| DMEM | Invitrogen | 12634-010 | 500ml |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| Glutamax | Gibco | 35050038 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| Hepes | Gibco | 15630056 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media) | Final concentration | ||
| A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 0.5µM |
| Adv+++ | make upto 100 ml | ||
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 1X |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50ng/mL |
| Gastrin | Tocris | 3006-1mg | 10 nM |
| NAC | Sigma | A9125-25G | 1.25mM |
| NIC | Sigma | N0636-100G | 10mM |
| Noggin CM | In house* | 10% | |
| P38 inhibitor (SB202190) | Sigma | S7076-25 mg | 10µM |
| PGE2 | Tocris | 2296/10 | 10 nM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1ml/500ml media |
| RSpoI CM | In house* | 20% | |
| Wnt3a CM | In house* | 50% | |
| In house* – cell lines will be provided upon request | |||
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media) | To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME) | ||
| LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media) | Final concentration | ||
| Adv+++ | make upto 100 ml | ||
| ALK-I A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 500nM |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 0.0763888889 |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100ng/ml |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 25ng/ml |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9125-25G | 1.25mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 5mM |
| Noggin UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| p38 MAPK-I | Sigma | S7076-25 mg | 1µM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1:500 |
| RhoKI Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817_100 mg | 2.5µm |
| Rspo UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection) | Final concentration | ||
| L-Glutathione reduced | Sigma | G4251-10MG | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Betaine | Sigma | 61962 | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| L-Cysteine | Sigma | 168149-2.5G | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Linoleic acid | Sigma | L1376-10MG | 6.8 μg/ml of OME/OMD /LOM |
| Taurine | Sigma | T0625-10MG | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Blocking buffer (for immunoflourescence staining) | Final concentration | ||
| Donkey/Goat serum | Bio-Rad | C06SB | 2% |
| PBS | Thermo-Fisher | 70011044 | Make upto 100ml |
| Tween 20 | Merck | P1379 | 0.1% |
| List of Antibodies used | |||
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Invitrogen | A-11011 | Dilution-1:500; RRID: AB_143157 |
| Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo | Waterborne, Inc | A400FLK | Dilution- 1:200 |
| Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive | Waterborne, Inc | IMS400-20 | Dilution-1:500 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Dilution-1:1000; RRID : AB_2629482 |
| Phalloidin-Alexa 674 | Invitrogen | A22287 | Dilution-1:1000; RRID: AB_2620155 |
| Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author). | Upon request | Upon request | Dilution-1:500 |
| Sporo-Glo | Waterborne, Inc | A600FLR-1X | Dilution- 1:200 |
References
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