Estudio de la infección por criptosporidio en sistemas de cultivo organoides humanos derivados del tejido 3D por microinyección

Summary

Describimos protocolos para preparar ovocitos y purificar esporozoitos para el estudio de la infección de organoides intestinales y de las vías respiratorias humanas por Cryptosporidium parvum. Demostramos los procedimientos para la microinyección de parásitos en el lumen organoide intestinal y la inmunomancha ción de organoides. Por último, describimos el aislamiento de los ovocitos generados de los organoides.

Abstract

Cryptosporidium parvum es una de las principales causas de la enfermedad diarreica humana. Para entender la patología del parásito y desarrollar fármacos eficientes, se necesita un sistema de cultivo in vitro que recapitula las condiciones en el huésped. Los organoides, que se asemejan mucho a los tejidos de su origen, son ideales para estudiar las interacciones huésped-parásito. Los organoides son estructuras tridimensionales (3D) derivadas del tejido que se derivan de células madre adultas y crecen en cultivo durante largos períodos de tiempo sin someterse a ninguna aberración o transformación genética. Tienen una polaridad bien definida con superficies apicales y basolaterales. Los organoides tienen varias aplicaciones en pruebas de drogas, biobanca, y modelado de enfermedades y estudios de interacción huésped-microbio. Aquí presentamos un protocolo paso a paso de cómo preparar los ovocitos y esporozoítos de Cryptosporidium para infectar los organoides intestinales y de las vías respiratorias humanas. A continuación, demostramos cómo se puede utilizar la microinyección para inyectar los microbios en el lumen organoide. Existen tres métodos principales por los que los organoides se pueden utilizar para los estudios de interacción huésped-microbio: microinyección, cizallamiento mecánico y chapado, y mediante la fabricación de monocapas. La microinyección permite el mantenimiento de la estructura 3D y permite un control preciso de los volúmenes del parásito y el contacto lateral apical directo para los microbios. Proporcionamos detalles para el crecimiento óptimo de organoides para la creación de imágenes u ovocitos. Por último, también demostramos cómo los ovocitos recién generados se pueden aislar del organoide para un mayor procesamiento y análisis aguas abajo.

Introduction

El desarrollo de fármacos o vacunas para el tratamiento y la prevención de la infección por Cryptosporidium se ha visto obstaculizado por la falta de sistemas in vitro que imitan con precisión la situación in vivo en los seres humanos^1,2. Muchos de los sistemas disponibles actualmente sólo permiten la infección a corto plazo (<5 días) o no soportan el ciclo de vida completo del parásito^3,4. Otros sistemas que permiten el desarrollo completo del parásito se basan en líneas celulares inmortalizadas o líneas celulares cancerosas que no recapitula....

Protocol

Todo el manejo y resección de tejidos se realizó bajo protocolos aprobados por la Junta de Revisión Institucional (IRB) con el consentimiento del paciente.

1. Preparación de C. parvum Oocysts for Injection

NOTA: Los ovocitos de Cryptosporidium se compraron en una fuente comercial (ver la Tabla de Materiales). Estos ovocitos se producen en terneros y se almacenan en solución salina con fosfato tampón (PBS) con antibióticos. Se pueden almacenar durante unos 3 meses a 4 oC y nunca deben congelarse. Normalmente usamos ovocitos dentro de un mes. Los organoides pueden e....

Results

Los protocolos presentados aquí dan como resultado la purificación eficiente de ovocitos y esporozoitos(Figura 1A)listos para la microinyección. El protocolo de excystation da como resultado la liberación de esporozoitos de aproximadamente el 70-80% de los ovocitos, por lo tanto, es esencial filtrar los ovocitos y conchas restantes a través de un filtro de 3 m. La filtración da como resultado una purificación de casi 100% esporozoita(Figura 1B). Además, la adici.......

Discussion

Cultivo de parásitos Cryptosporidium en organoides intestinales y de las vías respiratorias proporciona un modelo preciso para estudiar las interacciones huésped-parásito^10, pero también tiene muchas otras aplicaciones. Por ejemplo, los métodos actuales de selección y propagación de parásitos Cryptosporidium modificados genéticamente requieren el paso en ratones¹⁹ que no permite el aislamiento de parásitos que tienen modificaciones esenciales para la infec.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Extracto de membrana basal (matriz extracelular)	amsbio	3533-010-02
Anticuerpo Crypt-a-Glo (anticuerpo específico de ooquiste)	Waterborne, Inc	A400FLR-1X	Concentración final = Use 2-3 gotas/diapositiva
Crypto-Grab IgM recubierta de perlas magnéticas	Waterborne, Inc	IMS400-20
Bastidor Dynamag 15	Thermofisher Scientific	12301D
Dynamag 2 bastidor	Thermofisher Scientific	12321D
EMD Millipore  Filtros de membrana de policarbonato isopore- 3µ m	EMD-Millipore	TSTP02500
Tinte verde rápido	SIGMA	F7252-5G
Microinyector Femtojet 4i	Eppendorf	5252000013
Capilares de vidrio de 1 mm de diámetro	WPI	TW100F-4
Matrigel (matriz extracelular)	Corning	356237
Tubo de microfuga 1,5 mL	Eppendorf	T9661-1000EA
Puntas de microcargador	Eppendorf	612-7933
Extractor de micropipetas P-97	Instrumento de obturación	P-97
Suero de burro normal	Bio-Rad	C06SB
Penstrep	Gibco	15140-122
Hipoclorito de sodio (usar 5%)	Clorox	50371478
Correderas Super stick	Waterborne, Inc	S100-3
Swinnex-25 47 mm Portafiltros de policarbonato	EMD-Millipore	SX0002500
Ácido taurocólico sodio sal hidrato	SIGMA	T4009-5G
Tween-20	Merck	8221840500
Agente de montaje Vectashield	Vector Labs	H-1000
Vortex Genie 2	Industrias científicas, Inc	SI0236
Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)			Cantidad final
DMEM	Invitrogen	12634-010	500 mL
Penstrep	Gibco	15140-122	5 mL de stock en 500 mL DMEM
Glutamax	Gibco	35050038	5 mL de stock en 500 mL DMEM
Hepes	Gibco	15630056	5 mL de stock en 500 mL DMEM
ORGANOIDE INTESTINAL MEDIA-OME (Medios de expansión)<	fuerte>	<	fuerte>Concentración final
A83-01	Tocris	2939-50mg	0.5 y micro; M
Adv+++			Preparación de hasta 100 mL
B27	Invitrogen	17504044	1x
EGF	Peprotech	AF-100-15	50 ng/mL
Gastrin	Tocris	3006-1mg	10 nM
NAC	Sigma	A9125-25G	1.25 mM
NIC	Sigma	N0636-100G	10 mM
Noggin CM	En casa*		10%
Inhibidor de P38 (SB202190)	Sigma	S7076-25 mg	10 y micro; M
PGE2	Tocris	2296/10	10 nM
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1	1 mL/500 mL medios
RSpoI CM	En casa*		20%
Wnt3a CM	En casa*		50%
En la casa* - se proporcionarán líneas celulares a pedido
-OMD (Medios de diferenciación)			Para diferenciar los organoides, los organoides del intestino delgado en expansión se cultivaron en un medio rico en Wnt durante seis a siete días después de la división, y luego se cultivaron en un medio de diferenciación (retiro de Wnt, nicotinamida, SB202190, en un medio de diferenciación (retiro de Wnt, nicotinamida, SB202190, prostaglandina E2 de un medio rico en Wnt u OME)
MEDIOS ORGANOIDES PULMONARES- LOM (Medios de diferenciación)			Concentración final
Adv+++			Preparación de hasta 100 mL
ALK-I A83-01	Tocris	2939-50mg	500 nM
B27	Invitrogen	17504044	0.07638888889
FGF-10	Peprotech	100-26	100 ng/mL
FGF-7	Peprotech	100-19	25 ng/mL
N-acetilcisteína	Sigma	A9125-25G	1.25 mM
Nicotinamida	Sigma	N0636-100G	5 mM
Noggin UPE	U-Protein Express	Contactar con la empresa directamente	10%
p38 MAPK-I	Sigma	S7076-25 mg	1 y micro; M
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1	1:500
RhoKI Y-27632	Abmole Bioscience	M1817_100 mg	2.5 µ m
Rspo UPE	U-Protein Express	Contactar directamente	10%
tampón reductor (para la resuspensión de ooquistes y esporozoítos para inyección)			Concentración final
L-Glutatión reducido	Sigma	G4251-10MG	0.5 μ g/μ L de OME/OMD/LOM
Betaína	Sigma	61962	0,5 μ g/μ L de OME/OMD/LOM
L-Cisteína	Sigma	168149-2.5G	0.5 μ g/μ L de ácido linoleico OME/OMD/LOM
	Sigma	L1376-10MG	6.8 μ g/mL de OME/OMD/LOM
Taurina	Sigma	T0625-10MG	0.5 μ g/μ L de tampón bloqueante < OME/OMD/LOMfuerte
> (para la tinción por inmunofluorescencia)			Concentración final
Burro/Suero de cabra	Bio-Rad	C06SB	2%
PBS	Thermo-Fisher	70011044	Fabricación de hasta 100 mL
Tween 20	Merck	P1379	0.1%
Lista de anticuerpos utilizados
Alexa 568 cabra anti-conejo	Invitrogen	A-11011	Dilución-1:500; RRID: AB_143157
Kit completo Crypt-a-Glo- Anticuerpo marcado con fluoresceína Crypto-Glo	Waterborne, Inc	A400FLK	Dilución- 1:200
Crypta-Grab IMS Beads- Perlas magnéticas recubiertas de anticuerpo monoclonal reactivo	Waterborne, Inc	IMS400-20	Dilución-1:500
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	Dilución-1:1,000; RRID : AB_2629482
Phalloidin-Alexa 674	Invitrogen	A22287	Dilución-1:1.000; RRID: AB_2620155
Anticuerpo anti-gp15 de conejo generado por R. M. O' Connor (coautor).	A petición	A petición	Dilución-1:500
Sporo-Glo	Waterborne, Inc	A600FLR-1X	Dilución- 1:200