Estudio de la infección por criptosporidio en sistemas de cultivo organoides humanos derivados del tejido 3D por microinyección
Summary
Describimos protocolos para preparar ovocitos y purificar esporozoitos para el estudio de la infección de organoides intestinales y de las vías respiratorias humanas por Cryptosporidium parvum. Demostramos los procedimientos para la microinyección de parásitos en el lumen organoide intestinal y la inmunomancha ción de organoides. Por último, describimos el aislamiento de los ovocitos generados de los organoides.
Abstract
Cryptosporidium parvum es una de las principales causas de la enfermedad diarreica humana. Para entender la patología del parásito y desarrollar fármacos eficientes, se necesita un sistema de cultivo in vitro que recapitula las condiciones en el huésped. Los organoides, que se asemejan mucho a los tejidos de su origen, son ideales para estudiar las interacciones huésped-parásito. Los organoides son estructuras tridimensionales (3D) derivadas del tejido que se derivan de células madre adultas y crecen en cultivo durante largos períodos de tiempo sin someterse a ninguna aberración o transformación genética. Tienen una polaridad bien definida con superficies apicales y basolaterales. Los organoides tienen varias aplicaciones en pruebas de drogas, biobanca, y modelado de enfermedades y estudios de interacción huésped-microbio. Aquí presentamos un protocolo paso a paso de cómo preparar los ovocitos y esporozoítos de Cryptosporidium para infectar los organoides intestinales y de las vías respiratorias humanas. A continuación, demostramos cómo se puede utilizar la microinyección para inyectar los microbios en el lumen organoide. Existen tres métodos principales por los que los organoides se pueden utilizar para los estudios de interacción huésped-microbio: microinyección, cizallamiento mecánico y chapado, y mediante la fabricación de monocapas. La microinyección permite el mantenimiento de la estructura 3D y permite un control preciso de los volúmenes del parásito y el contacto lateral apical directo para los microbios. Proporcionamos detalles para el crecimiento óptimo de organoides para la creación de imágenes u ovocitos. Por último, también demostramos cómo los ovocitos recién generados se pueden aislar del organoide para un mayor procesamiento y análisis aguas abajo.
Introduction
El desarrollo de fármacos o vacunas para el tratamiento y la prevención de la infección por Cryptosporidium se ha visto obstaculizado por la falta de sistemas in vitro que imitan con precisión la situación in vivo en los seres humanos1,2. Muchos de los sistemas disponibles actualmente sólo permiten la infección a corto plazo (<5 días) o no soportan el ciclo de vida completo del parásito3,4. Otros sistemas que permiten el desarrollo completo del parásito se basan en líneas celulares inmortalizadas o líneas celulares cancerosas que no recapitulan fielmente la situación fisiológica en los seres humanos5,6,7 . Los organoides o ‘mini-órganos’ son estructuras derivadas de tejido 3D que se cultivan en una matriz extracelular complementada con varios factores de crecimiento específicos del tejido. Los organoides se han desarrollado a partir de diversos órganos y tejidos. Son genéticamente estables y recapitulan la mayoría de las funciones de los órganos de su origen, y pueden mantenerse en cultivo durante largos períodos de tiempo. Hemos desarrollado un método para infectar los organoides intestinales y pulmonares humanos con Cryptosporidium que proporciona un modelo in vitro preciso para el estudio de las interacciones huésped-parásito relevantes para la criptosporidiosis intestinal y respiratoria8 ,9,10,11,12,13. A diferencia de otros modelos de cultivo publicados, el sistema organoide es representativo de las interacciones del parásito huésped de la vida real, permite completar el ciclo de vida para que se puedan estudiar todas las etapas del ciclo de vida del parásito y mantiene la propagación del parásito hasta 28 días10.
Cryptosporidium parvum es un parásito apicomplexiano que infecta el epitelio de las vías respiratorias e intestinales, causando una enfermedad diarreica prolongada. La etapa ambiental resistente es el ovocitos, que se encuentra en los alimentos contaminados y el agua14. Una vez ingeridos o inhalados, el ovocitos y libera cuatro esporozoitos que se unen a las células epiteliales. Los esporozoítos se deslizan sobre las células de los huésped y atraen a los receptores de células huésped, pero el parásito no invade completamente la célula, y parece inducir a la célula huésped a engullirla15. El parásito, que se internaliza dentro de un compartimento intracelular pero extractitoplasma, permanece en la superficie apical de la célula, replicando dentro de una vacuola parasitoforosa. Se somete a dos rondas de reproducción asexual, un proceso llamado merogonía. Durante la merogonía, se desarrollan merontas tipo I que contienen ocho merozoitas que se liberan para invadir nuevas células. Estos merozoítos invaden nuevas células para convertirse en merontas de tipo II que contienen cuatro merozoitas. Estos merozoítos, cuando se liberan, infectan las células y se convierten en macrogamontes y microgamontes. Los microgametos se liberan y fertilizan los macrogametos que producen cigotes que maduran en ovocitos. Los ovocitos maduros se liberan posteriormente en el lumen. Los ovocitos son de paredes delgadas que se exquistan inmediatamente para reinfectar el epitelio, o paredes gruesas que se liberan en el medio ambiente para infectar al siguiente huésped14. Todas las etapas del ciclo de vida de Cryptosporidium han sido identificadas en el sistema de cultivo organoide previamente desarrollado por nuestro grupo10.
Dado que los organoides humanos replican fielmente los tejidos humanos9,11,13, y apoyan todas las etapas replicativas de Cryptosporidium10,son el sistema de cultivo de tejido ideal para estudiar Biología criptosporidio e interacciones huésped-parásito. Aquí describimos los procedimientos para infectar organoides con ovocitos de Cryptosporidium y esporozoitos exquistes, y aislar los nuevos ovocitos producidos en este sistema de cultivo de tejidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cultivo de parásitos Cryptosporidium en organoides intestinales y de las vías respiratorias proporciona un modelo preciso para estudiar las interacciones huésped-parásito10, pero también tiene muchas otras aplicaciones. Por ejemplo, los métodos actuales de selección y propagación de parásitos Cryptosporidium modificados genéticamente requieren el paso en ratones19 que no permite el aislamiento de parásitos que tienen modificaciones esenciales pa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos agradecidos a Deborah A. Schaefer de la Escuela de Ciencias Biomédicas Animales y Comparadas, Facultad de Agricultura y Ciencias de la Vida, Universidad de Arizona, Tucson, AZ, EE. UU. por ayudarnos con la producción y análisis de ovocitos. También agradecemos a Franceschi Microscopy and Imaging Center y a D.L. Mullendore de la Universidad Estatal de Washington por la preparación de TEM y la toma de imágenes de ovocitos organoides aislados.
D.D. es beneficiario de una subvención VENI de la Organización Neerlandesa de Investigación Científica (NWO-ALW, 016.Veni.171.015). I.H. es galardonado con una beca VENI de la Organización Neerlandesa de Investigación Científica (NWO-ALW, 863.14.002) y recibió el apoyo de becas Marie Curie de la Comisión Europea (Propuesta 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). La investigación que ha llevado a estos resultados ha recibido financiación del Consejo Europeo de Investigación en virtud del Acuerdo Avanzado de Subvenciones DEL ERC no 67013 y del NIH NIAIH en virtud de R21 AT009174 a RMO. Este trabajo es parte del Instituto Oncode, que es financiado en parte por la Sociedad Holandesa contra el Cáncer y fue financiado por una subvención de la Sociedad Holandesa contra el Cáncer.
Materials
| Basement membrane extract (extracellular matrix) | amsbio | 3533-010-02 | |
| Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody) | Waterborne, Inc | A400FLR-1X | Final Concentration = Use 2-3 drops/slide |
| Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads | Waterborne, Inc | IMS400-20 | |
| Dynamag 15 rack | Thermofisher Scientific | 12301D | |
| Dynamag 2 rack | Thermofisher Scientific | 12321D | |
| EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µm | EMD-Millipore | TSTP02500 | |
| Fast green dye | SIGMA | F7252-5G | |
| Femtojet 4i Microinjector | Eppendorf | 5252000013 | |
| Glass capillaries of 1 mm diameter | WPI | TW100F-4 | |
| Matrigel (extracellular matrix) | Corning | 356237 | |
| Microfuge tube 1.5ml | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Micro-loader tips | Eppendorf | 612-7933 | |
| Micropipette puller P-97 | Shutter instrument | P-97 | |
| Normal donkey Serum | Bio-Rad | C06SB | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium hypoclorite (use 5%) | Clorox | 50371478 | |
| Super stick slides | Waterborne, Inc | S100-3 | |
| Swinnex-25 47mm Polycarbonate filter holder | EMD-Millipore | SX0002500 | |
| Taurocholic acid sodium salt hydrate | SIGMA | T4009-5G | |
| Tween-20 | Merck | 8221840500 | |
| Vectashield mounting agent | Vector Labs | H-1000 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries, Inc | SI0236 | |
| Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes) | Final amount | ||
| DMEM | Invitrogen | 12634-010 | 500ml |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| Glutamax | Gibco | 35050038 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| Hepes | Gibco | 15630056 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media) | Final concentration | ||
| A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 0.5µM |
| Adv+++ | make upto 100 ml | ||
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 1X |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50ng/mL |
| Gastrin | Tocris | 3006-1mg | 10 nM |
| NAC | Sigma | A9125-25G | 1.25mM |
| NIC | Sigma | N0636-100G | 10mM |
| Noggin CM | In house* | 10% | |
| P38 inhibitor (SB202190) | Sigma | S7076-25 mg | 10µM |
| PGE2 | Tocris | 2296/10 | 10 nM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1ml/500ml media |
| RSpoI CM | In house* | 20% | |
| Wnt3a CM | In house* | 50% | |
| In house* – cell lines will be provided upon request | |||
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media) | To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME) | ||
| LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media) | Final concentration | ||
| Adv+++ | make upto 100 ml | ||
| ALK-I A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 500nM |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 0.0763888889 |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100ng/ml |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 25ng/ml |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9125-25G | 1.25mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 5mM |
| Noggin UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| p38 MAPK-I | Sigma | S7076-25 mg | 1µM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1:500 |
| RhoKI Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817_100 mg | 2.5µm |
| Rspo UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection) | Final concentration | ||
| L-Glutathione reduced | Sigma | G4251-10MG | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Betaine | Sigma | 61962 | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| L-Cysteine | Sigma | 168149-2.5G | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Linoleic acid | Sigma | L1376-10MG | 6.8 μg/ml of OME/OMD /LOM |
| Taurine | Sigma | T0625-10MG | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Blocking buffer (for immunoflourescence staining) | Final concentration | ||
| Donkey/Goat serum | Bio-Rad | C06SB | 2% |
| PBS | Thermo-Fisher | 70011044 | Make upto 100ml |
| Tween 20 | Merck | P1379 | 0.1% |
| List of Antibodies used | |||
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Invitrogen | A-11011 | Dilution-1:500; RRID: AB_143157 |
| Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo | Waterborne, Inc | A400FLK | Dilution- 1:200 |
| Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive | Waterborne, Inc | IMS400-20 | Dilution-1:500 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Dilution-1:1000; RRID : AB_2629482 |
| Phalloidin-Alexa 674 | Invitrogen | A22287 | Dilution-1:1000; RRID: AB_2620155 |
| Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author). | Upon request | Upon request | Dilution-1:500 |
| Sporo-Glo | Waterborne, Inc | A600FLR-1X | Dilution- 1:200 |
References
- Checkley, W., et al. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium. The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).
- Bones, A. J., et al. Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research. Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).
- Muller, J., Hemphill, A. In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals. International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).
- Karanis, P., Aldeyarbi, H. M. Evolution of Cryptosporidium in vitro culture. International Journal for Parasitology. 41 (12), 1231-1242 (2011).
- Morada, M., et al. Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology. International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).
- DeCicco RePass, M. A., et al. Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum. Infection and Immunity. 85 (3), (2017).
- Miller, C. N., et al. A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology. International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modelling. bioRxiv. , (2018).
- Dutta, D., Clevers, H. Organoid culture systems to study host-pathogen interactions. Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- O’Hara, S. P., Chen, X. M. The cell biology of Cryptosporidium infection. Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).
- Lendner, M., Daugschies, A. Cryptosporidium infections: molecular advances. Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).
- Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells. Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).
- O’Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens. Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).
- Wilke, G., et al. Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro. mSphere. 3 (3), (2018).
- Vinayak, S., et al. Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum. Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
