Summary
Descriviamo protocolli per preparare le oocisti e purificare gli sporozoiti per studiare l'infezione degli organoidi intestinali e delle vie aeree da Cryptosporidium parvum. Dimostriamo le procedure per la microiniezione di parassiti nel lume organoide intestinale e l'immunostaining degli organoidi. Infine, descriviamo l'isolamento delle oocisti generate dagli organoidi.
Abstract
Cryptosporidium parvum è una delle principali cause della malattia della diarrea umana. Per comprendere la patologia del parassita e sviluppare farmaci efficienti, è necessario un sistema di coltura in vitro che riassume le condizioni nell'ospite. Gli organiidi, che assomigliano molto ai tessuti della loro origine, sono ideali per studiare le interazioni ospite-parassita. Gli organiidi sono strutture derivate da tessuti tridimensionali (3D) che derivano da cellule staminali adulte e crescono in coltura per lunghi periodi di tempo senza subire alcuna aberrazione genetica o trasformazione. Hanno una polarità ben definita con superfici apicali e basolaterali. Gli organiidi hanno varie applicazioni nei test farmacologici, nel bio banking e nella modellazione della malattia e negli studi sull'interazione tra host e microbo. Qui presentiamo un protocollo passo-passo di come preparare le oocisti e sporozoiti di Cryptosporidium per infettare gli organoidi intestinali e delle vie aeree umane. Dimostriamo quindi come la microiniezione può essere utilizzata per iniettare i microbi nel lume organoide. Ci sono tre metodi principali con cui gli organoidi possono essere utilizzati per gli studi di interazione host-microbe: microiniezione, tosatura meccanica e placcatura, e facendo monostrati. La microiniezione consente il mantenimento della struttura 3D e consente un controllo preciso dei volumi di parassiti e il contatto laterale apicale diretto per i microbi. Forniamo dettagli per una crescita ottimale degli organoidi per la produzione di imaging o oocisti. Infine, dimostriamo anche come le oocisti appena generate possono essere isolate dall'organoid per un'ulteriore elaborazione e analisi a valle.
Introduction
Lo sviluppo di farmaci o vaccini per il trattamento e la prevenzione dell'infezione da Cryptosporidium è stato ostacolato dalla mancanza di sistemi in vitro che imitano precisamente la situazione in vivonell'uomo 1,2. Molti dei sistemi attualmente disponibili consentono solo l'infezione a breve termine (<5 giorni) o non supportano l'intero ciclo di vita del parassita3,4. Altri sistemi che consentono il completo sviluppo del parassita si basano su linee cellulari immortalate o linee cellulari tumorali che non ricapitolano fedelmente la situazione fisiologicanell'uomo 5,6,7 . Gli organoidi o "mini-organi" sono strutture derivate di tessuto 3D che vengono coltivate in una matrice extracellulare integrata con vari fattori di crescita specifici del tessuto. Gli organiidi sono stati sviluppati da vari organi e tessuti. Sono geneticamente stabili e riassumono la maggior parte delle funzioni degli organi della loro origine, e possono essere mantenuti in coltura per lunghi periodi di tempo. Abbiamo sviluppato un metodo per infettare gli organoidi intestinali e polmonari umani con il Cryptosporidium che fornisce un modello accurato in vitro per lo studio delle interazioni ospite-parassita rilevanti per la criptosporidiosi intestinale e respiratoria8 ,9,10,11,12,13. A differenza di altri modelli di coltura pubblicati, il sistema organoide è rappresentativo delle interazioni reali dell'ospite, consente il completamento del ciclo di vita in modo che tutte le fasi del ciclo di vita dei parassiti possano essere studiate e mantenga la propagazione dei parassiti per un massimo di 28 giornie 10.
Cryptosporidium parvum è un parassita apicomplexa che infetta l'epitelio dei tratti respiratori e intestinali, causando una malattia di diarrea prolungata. Lo stadio ambientale resistente è l'oocisti, che si trova negli alimenti e nell'acqua contaminati14. Una volta ingerito o inalato, l'oocisti si estingo e rilascia quattro sporozoiti che si attaccano alle cellule epiteliali. Gli sporozoiti scivolano sulle cellule ospiti e coinvolgono i recettori delle cellule ospiti, ma il parassita non invadere completamente la cellula e sembra indurre la cellula ospite a inghiottirla15. Il parassita, che viene interiorizzato all'interno di un compartimento intracellulare ma extracitoplasmatica, rimane sulla superficie apicale della cellula, replicandosi all'interno di un vacuolo parassofoso. Subisce due cicli di riproduzione asessuata, un processo chiamato merogonia. Durante la meroginia, si sviluppano meronts di tipo I che contengono otto merozoiti che vengono rilasciati per invadere nuove cellule. Questi merozoiti invadono nuove cellule per svilupparsi in meront di tipo II contenenti quattro merozoiti. Questi merozoiti, una volta rilasciati, infettano le cellule e si sviluppano in macrogamont e microgamont. I microgameti vengono rilasciati e fertilizzano i macrogameti che producono zigoti che maturano in oocisti. Le oocisti mature vengono successivamente rilasciate nel lume. Le oocisti sono o a parete sottile che immediatamente si estesciper reinfettare per reinfettare l'epitelio, o spesse mura che vengono rilasciate nell'ambiente per infettare il prossimo ospite14. Tutte le fasi del ciclo di vita di Cryptosporidium sono state identificate nel sistema di coltura organoide precedentemente sviluppato dal nostro gruppo10.
Dal momento che gli organoidi umani replicano fedelmente i tessuti umani9,11,13, e supportano tutte le fasi replicative del Cryptosporidium10, sono il sistema di coltura dei tessuti ideale per studiare Biologia del cryptosporidium e interazioni ospite-parassita. Qui descriviamo le procedure per infettare gli organoidi sia con le oocisti di Cryptosporidium che con gli sporozoiti eccitati e per isolare le nuove oocisti prodotte in questo sistema di coltura tissutale.
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Protocol
Tutta la manipolazione e la resezione dei tessuti è stata eseguita in base ai protocolli approvati dall'IRB (Institutional Review Board) con il consenso del paziente.
1. Preparazione di C. parvum Oocysts per l'iniezione
NOT: Cryptosporidium oocisti sono stati acquistati da una fonte commerciale (vedi la Tabella dei Materiali). Queste oocisti sono prodotte in vitelli e sono conservate in salina tampone di fosfato (PBS) con antibiotici. Possono essere conservati per circa 3 mesi a 4 gradi centigradi e non devono mai essere congelati. Normalmente usiamo le oocisti entro un mese. Gli organoidi possono essere infettati da oocisti intatti, o gli sporozoiti possono essere isolati dalle oocisti eccitati e utilizzati per infettare gli organoidi se è importante non avere oocisti riporto dall'inoculo originale.
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Preparare le oocisti di Cryptosporidium per infettare le cellule (Figura 1A).
- Mantenere le oocisti sul ghiaccio in tutte le manipolazioni fino a quando non vengono aggiunti agli organoidi.
- Calcolare il numero di oocisti necessari per una piastra completa a sei pozze di organoidi (di solito circa 5 x 105–2,5 x 105 per la piastra). Contare il numero di oocisti in un emocitometro per verificare la quantità e trasferirla in un tubo di centrifuga.
NOT: Per facilitare la visualizzazione, le oocisti possono essere mescolate 1:1 con un anticorpo fluorescente specifico per l'oocisti (vedi la tabella dei materiali) prima di essere caricate sull'emocitometro. Le oocisti con etichettatura fluoroforo possono quindi essere facilmente visualizzate ed enumerate utilizzando un microscopio a fluorescenza. Si consiglia di iniettare circa 100-1.000 oocisti/organoidi. In generale, 1.000-2.000 organoidi possono essere coltivati in una piastra di sei pozze. - Portare il volume della sospensione delle ovociti fino a 900 gradi con PBS. Aggiungere 100 l di ipoclorito di sodio (ad esempio, Clorox) candeggina (a 4 gradi centigradi). Incubare per 10 min sul ghiaccio.
- Centrifuga per 3 min in una microcentrifuga a 8.000 x g a 4 gradi centigradi. Orientare i tubi nella centrifuga con l'apertura del tappo rivolto verso l'interno. Il pellet può essere difficile da vedere in modo da sapere dove i parassiti hanno spinto nel tubo è essenziale.
- Rimuovere il supernatante con una pipetta facendo attenzione ad evitare il pellet. Aggiungere 1 mL del mezzo di Dulbecco modificato Eagle (DMEM) e vortice da mescolare.
- Centrifuga per 3 min in una microcentrifuga a 8.000 x g a 4 gradi centigradi.
- Ripetere i lavatori con DMEM altre due volte.
- Preparare il supporto di espansione (OME) o il mezzo organoide di differenziazione (OMD) a cui è stato aggiunto il taurocholate a una concentrazione finale dello 0,5% (w/v) (vedere Tabella dei materiali). Il taurocolata deve sempre essere preparato e aggiunto fresco.
NOT: Abbiamo utilizzato con successo lo 0,5% di taurocholato nei nostri saggi di infezione in cui l'inoculum è oocisti intatti, e abbiamo visto tassi migliorati di infezione senza effetti deleteri sulle cellule ospiti. Tuttavia, il taurocholate può avere effetti imprevisti sulle cellule, e concentrazioni più basse sono state utilizzate con successo nei saggi di infezione16. - Risospendere le oocisti in 100 gradi centigradi di coltura organoide medio integrato con 0.5% (w/v) taurocholate di sodio. Contare nuovamente le oocisti come descritto nel passaggio 1.1.2.
- Aggiungere colorno verde veloce alla sospensione per visualizzare l'iniezione.
- Riempire le punte del micro-caricatore (vedere la Tabella dei Materiali) con la sospensione dell'oocistia e usarla per riempire i capillari tirati.
ATTENZIONE: L'intera procedura dovrebbe essere eseguita in una cappa di coltura tissutale con protocolli di sicurezza di livello 2. L'uso di maschere è raccomandato come Cryptosporidium oocisti può anche essere infettivo quando in volo.
2. Purificazione in vitro di Sporozoites da C. parvum Oocysts
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Purificare gli sporozoiti da C. parvum oocyiss dopo lo sbiancamento e il lavaggio della candeggina come descritto sopra.
- Trasferire le ovociti in un tubo da 15 mL. Risospendere le oocisti nel mezzo di escissimento a temperatura ambiente (0,75% w/v taurocholate di sodio in DMEM) per ottenere 1 x 107 oocisti/mL. L'aggiunta di taurocholate migliora il tasso di esocissimento delle oocisti, migliorando la resa sporozoite.
- Incubare la sospensione dell'ovocita a 37 gradi centigradi per 1–1,5 h.
- Controllare il campione microscopicamente per l'estensione dell'escissioni; 60-80% escissioni è ragionevole per un buon recupero di sporozoiti. Se il livello di escissioni è basso, incubare più a lungo (altri 30 min a 1 h).
- Determinare la percentuale di emocidazione rispetto al numero di oocisti iniziali. Excystation viene calcolato come:
% di escidazione : [1 – (numero di oocisti intatti/numero di oocisti all'inizio)] x 100 - Lavare le cellule per rimuovere i reagenti di escissione aggiungendo 14 mL di PBS o media, mescolando e recuperando le cellule (oocisti intatti, gusci di oocisti e sporozoiti) per centrifugazione a 3.400 x g per 20 min per recuperare sporozoites. Aspirate con attenzione per evitare di perdere le cellule.
- Risospendere il pellet sporozoite in 1-2 mL di DMEM per ottenere 3 x 107 oocisti/mL (in base al numero di oocisti iniziali).
- Per rimuovere le oocisti e le shell rimanenti, filtrare la sospensione tramite un filtro di 3 m (Figura 1B). Utilizzare un apparato portafiltri da 47 mm dotato di filtro in policarbonato (dimensione dei pori di 3 m) collegato a un barile di siringa da 10 mL. Posizionare l'apparecchio del supporto del filtro sopra un tubo da 15 mL. Collocare l'assieme in un secchio di ghiaccio o in una stanza fredda.
- Aggiungere 7,5 mL della sospensione sporozoite al gruppo del filtro e lasciare filtrare per gravità. Lavare con altri 7,5 mL di DMEM.
NOT: Per garantire il successo nell'isolamento sporozoite, le oociti fresche e le buone esocienze sono fondamentali. Se ci sono troppe oocisti non esandati, la sospensione non scorrerà attraverso per gravità. L'applicazione di pressione sulla siringa può forzare le oocisti non esordite. La microiniezione di sporozoiti è più impegnativa di quella delle oocisti perché gli sporozoiti possono bloccarsi e bloccare il capillare. Per evitare questo, si consiglia di fare una punta capillare più ampia quando si inietta organoidi con sporozoiti. Per raggiungere livelli sufficienti di infezione, 2-4 volte il numero di sporozoiti deve essere iniettato in ogni organoide rispetto agli organoidi infettati da oocisti. - Centrifugare la sospensione sporozoite filtrata a 3.400 x g utilizzando un rotore a benna oscillante per 20 min a pellet sporozoites.
- Risospendere in 50-100 - L di OME o OMD organoid e mezzo di coltura organoide (vedi tabella dei materiali) integrato con 0.05% (w/v) Fast Green colorante e L-glutathione, betaina, L-cysteine, acido linoleico e taurina contenenti buffer5 (vedere il buffer di riduzione Tabella dei materiali).
NOT: Incubare le oocisti per troppo tempo può portare alla lisi delle sporozoiti e al scarso recupero e quindi dovrebbe essere evitato.
3. Cultura in vitro degli organiidi intestinali e polmonari per microiniezione
- Organiids intestinali della coltura in condizioni di mezzi di espansione e differenziazione.
nota:I dettagli della propagazione organoide intestinale e polmonare sono stati descritti in precedenza in altri articoli8,13(vedereTabella dei materialiper le ricette dei media). Qui, descriviamo brevemente il metodo di coltura organoide con riferimento specifico all'ottimizzazione perCryptosporidiuminiezione e crescita. Abbiamo scoperto che per l'imaging di parassiti negli organoidi, gli organoidi coltivati nel mezzo di espansione sono preferibili a quelli dei supporti di differenziazione cresciuti in quanto c'è meno accumulo di detriti rispetto a quello visto negli organoidi cresciuti nel mezzo di differenziazione. Tuttavia, se l'obiettivo è quello di isolare le oocisti, gli organoidi coltivati nei mezzi di differenziazione producono un numero molto più elevato di oocisti.- Mantenere gli organoidi nelle colture 3D in matrice extracellulare (vedere la Tabella dei Materiali)a 37 gradi centigradi. Aggiungi OME (supporti di espansione) in cima e aggiorna ogni giorno.
NOT: Per gli organoidi polmonari, non disponiamo di supporti di espansione e differenziazione separati. - Per dividere e piastra organoidi per microiniezione, rimuovere il supporto dalla piastra 6-pozzo contenente organoidi umani e aggiungere F12 s (Vedi la tabella dei materiali) al pozzo e rompere la matrice pipetta con una punta pipetta 1 mL più volte. Per ulteriori procedure è sufficiente raccogliere le cellule in un tubo da 15 mL (2 mL di F12 x per tubo).
- Aggiungete 10-12 mL di F12 in un altro tubo da 15 mL e mettete un tubo di vetro lucidato al fuoco nel mezzo, pipette su e giù 3 volte per rompere gli organoidi intestinali e polmonari umani.
NOT: Utilizzare un lungo tubo di vetro (20-30 cm) e lucidarlo brevemente. Non rendere l'apertura (diametro 1 mm) molto piccola perché gli organoidi possono essere danneggiati. Rendere la punta del tubo liscia da brevemente lucidatura del fuoco. Rompere gli organoidi in pezzi più piccoli di organoidi polmonari da 50 m. hanno una membrana esterna più spessa e quindi richiedono una tosatura più forte con la pipetta di vetro rispetto agli organoidi intestinali. Inoltre, hanno un tasso di crescita più lento rispetto agli organoidi intestinali (fino a 14 giorni tra ogni passaggio). - Aggiungere l'F12, fino a 5-7 mL e centrifugare a 350 x g per 5 min.
NOT: La velocità di centrifugazione in questo passaggio è superiore al normale per creare un buon pellet cellulare ben separato dalla matrice extracellulare (vedere la Tabella dei Materiali). Abbiamo osservato che rispetto agli organoidi intestinali piccoli di topo, gli organoidi intestinali piccoli umani sono più difficili da interrompere. - Rimuovere il più mezzo possibile senza disturbare le cellule, quindi rispendere il pellet con matrice mantenuta a 4 gradi centigradi; È richiesta una matrice di 200-300 litri per pozzo di una piastra a sei pozzetti. Gli organiidi devono essere divisi uno su tre per mantenere una densità cellulare abbastanza elevata.
- Placcare gli organoidi in goccioline di matrice di circa 5-10 gradi ciascuno nel pozzo di una piastra di sei pozzetti. Incubare per 20-30 min a 37 gradi centigradi e quindi aggiungere il mezzo di espansione (OME) in cima.
- Cambiare il mezzo ogni 2-3 giorni.
NOT: In circa 5-7 giorni, gli organoidi che crescono nei modelli raggiungono una dimensione di 100-200 m e sono pronti per l'iniezione. - Per differenziare gli organoidi, dopo 5-6 giorni in EM, cambiare i media in condizioni di differenziazione dei mezzi di trattamento (DM) e conservare per 5-6 giorni aggiuntivi prima di iniettare i parassiti.
NOT: Per l'espansione degli organoidi, si consiglia di placcare gli organoidi densamente. Per la microiniezione, si raccomanda l'uso di una piastra a sei pozzetto con organoidi placcati a densità inferiore. Ad esempio, gli organoidi a piastre da tre pozze di una piastra a sei pozzetto in una piastra completa a sei pozze per le microiniezioni. La matrice deve essere mantenuta a -20 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine e scongelata a 4 gradi centigradi o sul ghiaccio prima dell'uso. L'espansione degli organoidi polmonari è fatta in modo simile, ma l'utilizzo di componenti multimediali specifici organoidi polmonari (Tabella 1)8 .
- Mantenere gli organoidi nelle colture 3D in matrice extracellulare (vedere la Tabella dei Materiali)a 37 gradi centigradi. Aggiungi OME (supporti di espansione) in cima e aggiorna ogni giorno.
4. Microiniezione di oocisti/Sporozoiti nel Lumen Organoid
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Microinietta parassiti nel lato apicale dell'organoide 3D (Figura 2).
- Preparare capillari di 1 mm di diametro utilizzando un puller micropipette.
NOT: Le impostazioni utilizzate sull'emittente di micropipette (vedere La tabella dei materiali)sono: Calore - 663, Pull 100, Velocità : 200, Tempo 40 ms. Le impostazioni dovranno essere regolate in base alle istruzioni dell'utente per una particolare macchina. - Tagliare la punta del capillare con pinze. La dimensione/diametro dell'estremità capillare misura circa 9-12 m; ciò consente un facile flusso di oocisti (4-5 dimensioni m).
- Riempire i capillari con ovocitti o sospensioni sporozoite utilizzando punte micro-caricatore.
- Caricare il capillare pieno di oocisti su un microiniettore.
- Microinietta 100-200 nL sospensione in ogni organoide sotto un microscopio invertito a ingrandimento 5x, mantenendo la pressione costante. Dopo la microiniezione, aggiornare i supporti con OME o OMD ogni giorno e mantenere la piastra a 37 gradi centigradi.
NOT: Non usiamo un micromanipolatore per la microiniezione. L'uso dello stesso capillare è raccomandato per l'intero esperimento per garantire la stessa iniezione in ogni campione.
- Preparare capillari di 1 mm di diametro utilizzando un puller micropipette.
5. Immunofluorescenza Colorazione degli organoidi
- Raccogliere gli organoidi (1-2 x 24 pozze) con una pipetta P1000 in un tubo da 15 mL contenente F12.
- Organoidi pellet a 300 x g per 2 min, rimuovere il supernatante senza interrompere il pellet e convogliare delicatamente il pellet allentato nel volume rimanente.
- Aggiungere 5 mL di 2% paraformaldeide in PBS. Per evitare che gli organoidi si attacchino alla parete, non invertire il tubo. Lasciare che gli organoidi si depositino sul fondo del tubo e fissare a 4 gradi centigradi o 1 h a temperatura ambiente.
- Rimuovere il fissativo e aggiungere 10 mL di buffer di permeabilizzazione (0,2% Triton in PBS).
- Ruotare il tubo a temperatura ambiente per 20 min (questo assicura che tutti gli organoidi rimangano in sospensione).
- Pellet gli organoidi a 300 x g per 2 min, e poi scartare il supernatante.
- Risospendere delicatamente gli organoidi in 500 gradi di soluzione di blocco (vedere la tabella dei materiali)e trasferirli in un tubo di microcentrifuga da 2 mL.
- Incubare per 20 min a temperatura ambiente su uno shaker. Lasciare che gli organoidi si depositino sul fondo del tubo per gravità. Sostituire la soluzione di blocco con la soluzione anticorpale primaria (vedere La tabella dei materiali)e incubare per 1-2 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 gradi centigradi.
- Lavare 3x con PBS contenente lo 0,1% Tween. Lasciate che gli organoidi si sistemino ogni volta e rimuovano il super-natante.
- Aggiungere la soluzione anticorpale secondaria (vedere la tabella dei materiali) e incubare per 2 h a temperatura ambiente.
- Lavare 3x con PBS contenente lo 0,1% Tween. Lasciare 50 - L di PBS dopo il terzo lavaggio.
- Montare sul vetrino convogliando gli organoidi sospesi in 50 gradi di PBS sul vetrino. Rimuovere il PBS in eccesso, aggiungere una goccia di agente di montaggio (vedere la tabella dei materiali) e aggiungere lo coverslip in cima. Sigillare i lati con smalto e lasciarlo asciugare.
6. Isolamento delle oocisti dagli organiidi
- Isolare le oocisti appena formate dal lume organoide.
nota:Le oocisti sono isolate dagli organoidi mediante separazione immunomagnetica utilizzando un kit di isolamentoTabella dei materiali) con le modifiche descritte di seguito. Le oocisti isolate possono quindi essere analizzate mediante immunofluorescenza e microscopia elettronica.- Iniziare con organoidi differenziati che sono stati mantenuti in OMD per 5-7 giorni e che non sono infetti, infettati per 1 giorno e infettati per 5 giorni. Utilizzare i primi due come controlli negativi.
NOT: Abbiamo scoperto che gli organoidi differenziati producono più oocisti rispetto ai polmoni o all'espansione degli organoidi intestinali10. - Raccogliere gli organoidi in tubi di centrifuga da 15 mL. Centrifugare gli organoidi per 20 min a 3.000 x g e 10 gradi centigradi.
NOT: Questa alta velocità è necessaria per assicurarsi che nessuna oocisti venga persa da qualsiasi organoide che possa essere rotto. - Rimuovere il supporto organoide e sostituirlo con 5 mL di acqua.
- Rompere gli organoidi da ripetuti tubi vigorosi con una pipetta Pasteur in vetro lucidato dal fuoco.
- Se i grumi sono visibili, trasferire la sospensione organoide a un omogeneizzatore di vetro e omogeneizzare fino a quando gli organoidi sono ben disturbati. L'omogeneizzatore dounce non influenzerà le oocisti.
- Una volta che non ci sono grumi visibili, aggiungere 5 mL di buffer A dal kit di isolamento oocyst. Mescolare e aggiungere 120 l delle perline magnetiche rivestite con anti-oocisti IgM.
- Incubare le sospensioni cellulari e perline magnetiche per 2 h a temperatura ambiente con miscelazione continua su una piattaforma rocker.
- Alla fine dell'incubazione, posizionare i tubi contenenti cellule e perline su un rack di separazione magnetica progettato per tubi da 15 mL.
- Ruotare manualmente i tubi nel rack di separazione magnetica per 3 min. Le perline aderiscono al lato del tubo accanto al magnete.
- Con attenzione, con una pipetta da 10 mL, rimuovere il super-natante dalle perline. Risospendere le perline in 450 gradi di Buffer B e trasferirle in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml.
NOT: Mantenere il supernatore fino a quando l'isolamento delle oocisti è confermato. - Per raccogliere eventuali perline e oocisti rimanenti, lavare il tubo da 15 mL con 450 l'l di Buffer B e aggiungere questo lavaggio alle perline magnetiche nel tubo di microcentrismo.
- Ripetere il passaggio 6.1.11 ancora una volta. Tutte le perle e le oocisti catturate ora devono essere trasferite al tubo di microcentrifuga.
- Posizionare il tubo di microcentrifuga su un rack di separazione magnetica progettato per contenere i tubi di microcentrismo.
- Ruotare il tubo nel rack di separazione magnetica a mano per 3 min.
- Rimuovere con attenzione il supernatante con una pipetta in un nuovo tubo.
NOT: Mantenere il supernatore fino a quando l'isolamento delle oocisti è confermato. - Rimuovere il tubo di microcentrifuga contenente perline magnetiche e oocisti dal rack di separazione magnetica.
- Aggiungere 100 luna di 0,1 N HCl alle perline magnetiche per eluire le oocisti dalle perline. Vortice per 30 s.
NOT: Vortexer deve essere impostato su una velocità leggermente inferiore alla massima. - Incubare le perline in 0,1 N HCl per 10 min a temperatura ambiente.
- Vortice di nuovo. Quindi riporre il tubo sul rack di separazione magnetica. Attendere che le perline aderiscano al lato del tubo e quindi trasferire il supernatante in un nuovo tubo di microcentrifuga.
- Ripetere i passaggi da 6.1.17 a 6.1.19 e combinare il secondo eluato con la prima eluzione.
- Neutralizzare l'eluato con 20 :L di 1 N NaOH, o un altro buffer neutralizzante come 1 M Tris, pH 8.
- Per contare le oocisti, prendere 10 l dell'eluato, combinarlo con 10 : L di anticorpo specifico di oocisti (Vedere Tabella dei materiali) e contare le oocisti fluorescenti su un emocitometro.
NOT: Le oocisti isolate possono essere conservate a 4 gradi centigradi o utilizzate immediatamente per l'immunofluorescenza o l'imaging a microscopia elettronica.
- Iniziare con organoidi differenziati che sono stati mantenuti in OMD per 5-7 giorni e che non sono infetti, infettati per 1 giorno e infettati per 5 giorni. Utilizzare i primi due come controlli negativi.
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Representative Results
I protocolli qui presentati si traducono in un'efficiente purificazione di oocisti e sporozoiti (Figura 1A) pronti per la microiniezione. Il protocollo di esostation si traduce nel rilascio di sporozoiti da circa il 70-80% delle oocisti, quindi è essenziale filtrare le rimanenti oocisti e gusci attraverso un filtro da 3 m. Filtrazione risultati in quasi 100% sporozoite purificazione (Figura 1B). Inoltre, l'aggiunta di un coloranti verde aiuta a garantire l'iniezione di tutti gli organoidi e consente la visualizzazione di organoidi iniettati per almeno 24 h dopo l'iniezione (Figura 2B).
Questi protocolli per la preparazione di oocisti e sporozoiti sono semplici e sono stati utilizzati per molti anni, quindi si prevede che le oocisti trattati e gli sporozoiti purificati saranno vitali e infettivi. Tuttavia, nei nostri studi, abbiamo usato la microscopia elettronica a scansione per garantire che il processo di escissimento non danneggi le sporozoiti o le oocisti (Figura 2A)10. L'iniezione di quantità uguali di oocisti nel lume organoide può essere confermata visivamente da una semplice imaging microscopico (Figura 2C). Una parte degli organoidi infetti dovrebbe essere impostata per verificare la propagazione dei parassiti mediante PCR quantitativa come abbiamo descritto10.
I progressi nel ciclo di vita dei parassiti possono essere visualizzati mediante la raccolta di organiidi infetti in diversi punti temporali dopo l'infezione e l'analisi mediante microscopia elettronica di trasmissione o mediante immunofluorescenza combinata con 4,6-diamidino-2-fenilitinele ( DAPI) colorazione dei nuclei parassiorati10. Ad esempio, gli anticorpi agli antigeni della superficie di merozoite, come gp40 e gp1517 possono essere utilizzati per identificare gli stadi di meront; meronts di tipo I avranno 8 nuclei e meront di tipo II, 4 nuclei10. Recentemente, un pannello di anticorpi monoclonali specifici per trofozoiti, merozoiti, tipo I contro II meronts, e macrogamonts è diventato disponibile18. Questi anticorpi sarebbero anche molto efficaci nel segnare il progresso del parassita attraverso le sue varie fasi del ciclo di vita negli organoidi.
I saggi di immunofluorescenza possono anche essere utilizzati per esplorare quali tipi di cellule sono infettati dal Cryptosporidium. Questo era particolarmente importante da guardare negli organoidi delle vie aeree come molto poco si sa sulla criptosporidiosi respiratoria, e la cellula ospite esatta per il parassita non era conosciuta. Abbiamo condotto analisi dell'immunofluorescenza sugli organoidi infettati da Cryptosporidium,co-localizzando CC10, un marcatore per le cellule del club e abbiamo scoperto che il Cryptosporidium ha infettato sia le cellule negative che quelle positive CC10(Figura 3). Questi risultati sono stati confermati dai TEM in cui abbiamo osservato il Cryptosporidium infettare le cellule secretory e non secretorie nelle organoidi10.
Dopo che gli organoidi differenziati sono stati infettati per cinque giorni, ci dovrebbe essere un numero significativo di oocisti prodotti. Nelle nostre mani, l'infezione degli organoidi da una piastra a sei potraha prodotto circa 4000 oocisti, che potevano essere facilmente identificati e contati su un emocitometro etichettando con un anticorpo specifico per le ovocisti. La presenza di quattro sporozoiti nelle oocisti potrebbe essere confermata asciugando una parte delle oocisti su un vetrino adesivo, fissando con metanolo e combinando la colorazione DAPI con anticorpo specifico di oocisti (Figura 4). La verifica della produzione di oocisti murari spessi potrebbe essere effettuata mediante l'analisi TEM10.
Figura 1: Preparazione e purificazione di oocisti e sporozoiti di Cryptosporidium. (A) Rappresentazione schematica del metodo utilizzato per la preparazione dell'oocisti e della sporozoite per l'infezione. (B) Immagine che mostra in vitro excystation di oocisti. La filtrazione di ovociti e conchiglie non esorditi dà una soluzione purificata di sporozoiti. Barra di scala : 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Microiniezione di oocisti nel lume organoide. Questa cifra è stata modificata da Heo etal. (A) immagini di microscopia elettronica a scansione (SEM) di oocisti e sporozoiti. (B) Immagine che mostra organoidi iniettati di oocisti. Il colorante verde aiuta a visualizzare l'iniezione di ogni organoide e persiste su almeno 24 h. (C) Immagine di un organoide iniettato con oocisti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagine immunofluorescenza di Cryptosporidium-infettato organoide delle vie aeree. La mucina è etichettata con anticorpo anti-mucina 5 (rosso) nel lume dell'organoid, le cellule del club sono etichettate con anti-CC10 (giallo), Cryptosporidium viene rilevato con anticorpo oocyst-specifico (verde), e i nuclei cellulari sono macchiati con DAPI (blu). Pannello B è un allargamento dell'area indicata nel quadrato nel pannello A. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagine immunofluoreescenza di oocisti isolati da organoidi intestinali differenziati. La parete oocyst è etichettata con anticorpo specifico di oocisti in verde e i quattro nuclei sporozoite sono visualizzati con DAPI (blu) Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La coltura dei parassiti del Cryptosporidium negli organoidi intestinali e delle vie aeree fornisce un modello accurato per studiare le interazioni ospite-parassita10, ma ha anche molte altre applicazioni. Ad esempio, gli attuali metodi di selezione e propagazione dei parassiti del Cryptosporidium geneticamente modificati richiedono un passaggio nei topi19, il che non consente l'isolamento dei parassiti che hanno modifiche essenziali per l'infezione in vivo. La cultura organoide del Cryptosporidium offre un'alternativa a questa procedura. Tuttavia, abbiamo notato che le sporozoite elettroporate si aggregano e bloccano la micropipetta. Allo scopo di selezionare parassiti geneticamente modificati, gli organoidi possono essere coltivati su trasguarsi rivestiti di collagene in un formato bidimensionale in condizioni di differenziazione per consentire l'infezione da sporozoiti trasaffetti e di conseguenza la selezione di le oocisti geneticamente modificati. I transwell consentono l'accesso sia alle superfici apicaliche che a superfici basolaterali e sono stabili per lunghi periodi di tempo.
Attualmente, coltiviamo organoidi in un formato bidimensionale per lo screening ad alta produttività dei farmaci per organoidi derivati dal tessuto tumorale (dati inediti). Questo metodo di coltura organoide può anche essere adattato per il test di farmaci anti-Cryptosporidium utilizzando la luciferasi geneticamente modificata etichettata Cryptosporidium ceppi19. Inoltre, anche se l'infezione non è strettamente sincronizzata, l'infezione degli organoidi con sporozoiti fornisce una sincronizzazione sufficiente del ciclo di vita che i farmaci possono essere testati per la loro efficacia contro specifiche fasi del ciclo di vita.
I sistemi di cocoltura organoidi sono ora in fase di sviluppo tenendo conto di alcuni altri aspetti del sistema host come il microbiota e le cellule immunitarie20. Così, la capacità di sezionare le interazioni tra il parassita e le cellule ospiti, le cellule immunitarie e il microbiota sarà presto possibile in vitro. La manipolazione genetica del Cryptosporidium è ora possibile anche19, e la combinazione di ceppi di reporter fluorescenti di coltura Cryptosporidium e organoide fornirà gli strumenti per il sequenziamento a singola cellula delle cellule infette, e sequenziamento ancora più specifico a singola cellula delle cellule infettate da stadi specifici del parassita.
Il successo degli esperimenti qui descritti dipende fortemente dalla vitalità e dall'infettività delle oocisti. Diversi lotti di oocisti Cryptosporidium possono variare ampiamente nei tassi di escissioni e capacità di infettare le cellule ospiti. Le rese sufficienti di sporozoiti dipendono da buoni tassi di escisazione e il tasso di escissione non è sempre correlato all'infettività. Se si osservano bassi livelli di infezione o scarsa esostation con un particolare lotto di oocisti, il tempo e lo sforzo possono essere risparmiati ottenendo un nuovo sacco di oocisti piuttosto che tentare di aumentare il numero di oocisti, o allungando i tempi di incubazione.
I supporti di coltura organoidi devono essere aggiornati ogni giorno alternativo. Si consiglia l'uso di passaggi precedenti di colture organoidi. È importante scongelare una nuova fiala di organoidi se gli organoidi iniziano a differenziarsi nei passaggi successivi poiché la salute delle colture organoidi determina ampiamente la vitalità del parassita. Dopo l'infezione, i supporti organoidi dovrebbero essere aggiornati ogni giorno per evitare l'accumulo di sostanze tossiche nei supporti.
La coltura organoide del Cryptosporidium è limitata in quanto il parassita non può essere propagato a tempo indeterminato e l'infezione si provaso dopo tre passaggi in 28 giorni10. La microiniezione di organoidi sufficienti per esperimenti sui topi come abbiamo descritto può richiedere molto tempo e essere fisicamente faonda. Tuttavia, fino ad oggi, nessun altro metodo consente l'intero ciclo di vita in un sistema in vitro completamente rappresentativo dell'infezione umana, né è stato descritto alcun sistema di coltura che consenta di l'esplorazione delle interazioni ospite-patogeno importanti per infezione respiratoria. La coltura organoide del Cryptosporidium fornisce un nuovo potente strumento che apre vie di esplorazione in interazioni ospite-parassita non precedentemente possibili per Cryptosporidium.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Siamo grati a Deborah A. Schaefer della School of Animal and Comparative Biomedical Sciences, College of Agriculture and Life Sciences, Università dell'Arizona, Tucson, Az, USA per averci aiutato con la produzione e l'analisi degli oocisti. Ringraziamo anche Franceschi Microscopy and Imaging Center e D.L. Mullendore alla Washington State University per la preparazione e l'imaging di oocisti organoidi isolati.
D.D. è il destinatario di una sovvenzione VENI dell'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO-ALW, 016.Veni.171.015). I.H. è il destinatario di una sovvenzione VENI dell'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO-ALW, 863.14.002) ed è stata sostenuta dalle borse Marie Curie della Commissione europea (Proposta 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca nell'ambito del ERC Advanced Grant Agreement n. 67013 e da NIH NIAIH sotto R21 AT009174 a RMO. Questo lavoro fa parte dell'Oncode Institute, che è in parte finanziato dalla Società Olandese per il Cancro ed è stato finanziato da una sovvenzione della Società Olandese per il Cancro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basement membrane extract (extracellular matrix) | amsbio | 3533-010-02 | |
| Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody) | Waterborne, Inc | A400FLR-1X | Final Concentration = Use 2-3 drops/slide |
| Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads | Waterborne, Inc | IMS400-20 | |
| Dynamag 15 rack | Thermofisher Scientific | 12301D | |
| Dynamag 2 rack | Thermofisher Scientific | 12321D | |
| EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µm | EMD-Millipore | TSTP02500 | |
| Fast green dye | SIGMA | F7252-5G | |
| Femtojet 4i Microinjector | Eppendorf | 5252000013 | |
| Glass capillaries of 1 mm diameter | WPI | TW100F-4 | |
| Matrigel (extracellular matrix) | Corning | 356237 | |
| Microfuge tube 1.5 mL | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Micro-loader tips | Eppendorf | 612-7933 | |
| Micropipette puller P-97 | Shutter instrument | P-97 | |
| Normal donkey Serum | Bio-Rad | C06SB | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium hypoclorite (use 5%) | Clorox | 50371478 | |
| Super stick slides | Waterborne, Inc | S100-3 | |
| Swinnex-25 47 mm Polycarbonate filter holder | EMD-Millipore | SX0002500 | |
| Taurocholic acid sodium salt hydrate | SIGMA | T4009-5G | |
| Tween-20 | Merck | 8221840500 | |
| Vectashield mounting agent | Vector Labs | H-1000 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries, Inc | SI0236 | |
| Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes) | Final amount | ||
| DMEM | Invitrogen | 12634-010 | 500 mL |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| Glutamax | Gibco | 35050038 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| Hepes | Gibco | 15630056 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media) | Final concentration | ||
| A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 0.5 µM |
| Adv+++ | make up to 100 mL | ||
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 1x |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
| Gastrin | Tocris | 3006-1mg | 10 nM |
| NAC | Sigma | A9125-25G | 1.25 mM |
| NIC | Sigma | N0636-100G | 10 mM |
| Noggin CM | In house* | 10% | |
| P38 inhibitor (SB202190) | Sigma | S7076-25 mg | 10 µM |
| PGE2 | Tocris | 2296/10 | 10 nM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1 mL/500 mL media |
| RSpoI CM | In house* | 20% | |
| Wnt3a CM | In house* | 50% | |
| In house* - cell lines will be provided upon request | |||
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media) | To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME) | ||
| LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media) | Final concentration | ||
| Adv+++ | make up to 100 mL | ||
| ALK-I A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 500 nM |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 0.0763888889 |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 25 ng/mL |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9125-25G | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 5 mM |
| Noggin UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| p38 MAPK-I | Sigma | S7076-25 mg | 1 µM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1:500 |
| RhoKI Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817_100 mg | 2.5 µm |
| Rspo UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection) | Final concentration | ||
| L-Glutathione reduced | Sigma | G4251-10MG | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Betaine | Sigma | 61962 | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| L-Cysteine | Sigma | 168149-2.5G | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Linoleic acid | Sigma | L1376-10MG | 6.8 μg/mL of OME/OMD /LOM |
| Taurine | Sigma | T0625-10MG | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Blocking buffer (for immunoflourescence staining) | Final concentration | ||
| Donkey/Goat serum | Bio-Rad | C06SB | 2% |
| PBS | Thermo-Fisher | 70011044 | Make up to 100 mL |
| Tween 20 | Merck | P1379 | 0.1% |
| List of Antibodies used | |||
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Invitrogen | A-11011 | Dilution-1:500; RRID: AB_143157 |
| Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo | Waterborne, Inc | A400FLK | Dilution- 1:200 |
| Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive | Waterborne, Inc | IMS400-20 | Dilution-1:500 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Dilution-1:1,000; RRID : AB_2629482 |
| Phalloidin-Alexa 674 | Invitrogen | A22287 | Dilution-1:1,000; RRID: AB_2620155 |
| Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author). | Upon request | Upon request | Dilution-1:500 |
| Sporo-Glo | Waterborne, Inc | A600FLR-1X | Dilution- 1:200 |
References
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