Studere Cryptosporidium infektion i 3D vævs-afledte humane Organoid kultur systemer ved mikroinjektion
Summary
Vi beskriver protokoller til at forberede oocyster og rense sporozoiter til at studere infektion af humane tarm og luftvejs organoider af Cryptosporidium parvum. Vi demonstrerer procedurerne for mikroinjektion af parasitter i tarm organoid lumen og immun farvning af organoider. Endelig beskriver vi isolationen af genererede oocyster fra organoiderne.
Abstract
Cryptosporidium at er en af de vigtigste årsager til menneskelig diarré sygdom. At forstå patologi af parasitten og udvikle effektive lægemidler, et in vitro-kultur system, der rekapitulerer betingelserne i værten er nødvendig. Organoider, der ligner væv i deres oprindelse, er ideelle til at studere vært-parasisite interaktioner. Organoider er tredimensionale (3D) væv-afledte strukturer, som er afledt af voksne stamceller og vokse i kultur i længere perioder uden at gennemgå nogen genetisk aberration eller omdannelse. De har veldefinerede polaritet med både apikale og basolaterale overflader. Organoider har forskellige anvendelser i dopingtest, bio Banking, og sygdoms modellering og Host-Microbe interaktionsstudier. Her præsenterer vi en trin-for-trin protokol om, hvordan man forbereder oocyster og sporozoiter af Cryptosporidium til at inficere menneskelige tarm og luftvejene organoider. Vi viser derefter, hvordan mikroinjektion kan bruges til at injicere mikrober i organoid lumen. Der er tre vigtige metoder, som organoider kan bruges til Host-Microbe interaktionsstudier-mikroinjektion, mekanisk klipning og plating, og ved at gøre monolayers. Mikroinjektion muliggør vedligeholdelse af 3D-strukturen og giver mulighed for præcis kontrol af parasitisk volumen og direkte apikale side kontakt for mikroberne. Vi giver detaljer for optimal vækst af organoider til enten billeddannelse eller oocysttal produktion. Endelig viser vi også, hvordan de nyligt genererede oocyster kan isoleres fra organoid til yderligere downstream-behandling og analyse.
Introduction
Udvikling af lægemidler eller vacciner til behandling og forebyggelse af Cryptosporidium infektion er blevet hæmmet af manglen på in vitro-systemer, der præcist efterligner in vivo situationen i mennesker1,2. Mange af de i øjeblikket tilgængelige systemer enten kun tillader kortvarig infektion (< 5 dage) eller ikke understøtter den komplette livscyklus af parasiten3,4. Andre systemer, der muliggør en fuldstændig udvikling af parasitten, er baseret på immortaliserede cellelinjer eller Cancer cellelinjer, som ikke trofast gengør den fysiologiske situation i mennesker5,6,7 . Organoider eller ‘ mini-organer ‘ er 3D væv afledte strukturer, der dyrkes i en ekstracellulær matrix suppleret med forskellige vævsspecifikke vækstfaktorer. Organoider er udviklet fra forskellige organer og væv. De er genetisk stabile og rekapitulerer de fleste funktioner i organerne af deres oprindelse, og kan opretholdes i kulturen i længere tid. Vi har udviklet en metode til at inficere humane tarm-og lunge organoider med Cryptosporidium , der giver en nøjagtig in vitro-model til studiet af vært-parasisite interaktioner relevante for tarm og respiratorisk Cryptosporidiose8 ,9,10,11,12,13. I modsætning til andre offentliggjorte kultur modeller, er organoid-systemet repræsentativt for den virkelige værts parasitator interaktion, giver mulighed for færdiggørelse af livscyklus, således at alle stadier af parasitens livscyklus kan undersøgt, og opretholder parasisite formering i op til 28 dage10.
Cryptosporidium at er en apicomplexan parasisite, der inficerer epitel af de respiratoriske og intestinale skrifter, forårsager langvarig diarré sygdom. Den resistente miljømæssige fase er oocyst, findes i forurenet mad og vand14. Når det indtages eller inhaleres, oocysten excysts og frigiver fire sporozoiter, der binder sig til epiteliale celler. Sporozoiter glide på værter celler og engagere Host celle receptorer, men parasit ikke fuldt invadere cellen, og synes at inducere værten cellen til at opsluge det15. Parasitet, som er internaliseret i et intracellulært, men extracytoplasmic rum, forbliver på den apikale overflade af cellen, replikerer inden for en parasitophorous vakuole. Det gennemgår to runder af aseksuelle reproduktion-en proces kaldet merogony. Under merogony, type I meronts udvikle som indeholder otte merozoiter, der er frigivet til at invadere nye celler. Disse merozoiter invaderer nye celler for at udvikle sig til type II-meronter, der indeholder fire merozoiter. Disse merozoiter, når de frigives, inficere celler og udvikle sig til makro gamonter og mikrogamonter. Mikrogameter frigives og befrugte makrogametes, der producerer zygoter, som modnes til oocyster. Modne oocyster frigives efterfølgende i lumen. Oocyster er enten tyndvæggede, som umiddelbart excyst at reinficere Epitelet, eller tyk walled, som er frigivet i miljøet for at inficere den næste vært14. Alle stadier af Cryptosporidium livscyklus er blevet identificeret i organoid kultur system tidligere udviklet af vores gruppe10.
Da humane organoider trofast replikerer humane væv9,11,13og understøtter alle replikerende stadier af Cryptosporidium10, er de det ideelle vævskultur system til at studere Cryptosporidium biologi og vært-parasisite interaktioner. Her beskriver vi procedurerne for inficering af organoider med både Cryptosporidium oocyster og excysted sporozoiter og isolering af de nye oocyster, der produceres i dette vævskultur system.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kultur af Cryptosporidium parasitter i tarm og luftvejs organoider giver en præcis model til at studere vært-parasisite interaktioner10 men også har mange andre applikationer. For eksempel, nuværende metoder til udvælgelse og formeringsmateriale genetisk modificerede Cryptosporidium parasitter kræver passage i mus19 , som ikke tillader isolering af parasitter, der har ændringer afgørende for in vivo infektion. Organoid kultur af Cryptosporidium…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for Deborah A. Schaefer fra School of Animal og komparative Biomedical Sciences, College of Agriculture and Life Sciences, University of Arizona, Tucson, AZ, USA for at hjælpe os med oocysttal produktion og analyse. Vi takker også Franceschi Microscopy og Imaging Center og D.L. Mullendore på Washington State University for TEM forberedelse og billeddannelse af isolerede organoid oocyster.
D.D. er modtager af et VENI-stipendium fra den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO-ALW, 016. Veni. 171.015). I.H. er modtager af et VENI-stipendium fra den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO-ALW, 863.14.002) og blev støttet af Marie Curie-stipendier fra Europa-Kommissionen (forslag 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). Den forskning, der førte til disse resultater, har modtaget støtte fra Det Europæiske Forskningsråd under EFR’S avancerede tilskudsaftale nr. 67013 og fra NIH NIAIH under R21 AT009174 til RMO. Dette arbejde er en del af Oncode Institute, som delvis finansieres af det hollandske Cancer selskab og blev finansieret af et stipendium fra det hollandske Cancer selskab.
Materials
| Basement membrane extract (extracellular matrix) | amsbio | 3533-010-02 | |
| Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody) | Waterborne, Inc | A400FLR-1X | Final Concentration = Use 2-3 drops/slide |
| Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads | Waterborne, Inc | IMS400-20 | |
| Dynamag 15 rack | Thermofisher Scientific | 12301D | |
| Dynamag 2 rack | Thermofisher Scientific | 12321D | |
| EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µm | EMD-Millipore | TSTP02500 | |
| Fast green dye | SIGMA | F7252-5G | |
| Femtojet 4i Microinjector | Eppendorf | 5252000013 | |
| Glass capillaries of 1 mm diameter | WPI | TW100F-4 | |
| Matrigel (extracellular matrix) | Corning | 356237 | |
| Microfuge tube 1.5ml | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Micro-loader tips | Eppendorf | 612-7933 | |
| Micropipette puller P-97 | Shutter instrument | P-97 | |
| Normal donkey Serum | Bio-Rad | C06SB | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium hypoclorite (use 5%) | Clorox | 50371478 | |
| Super stick slides | Waterborne, Inc | S100-3 | |
| Swinnex-25 47mm Polycarbonate filter holder | EMD-Millipore | SX0002500 | |
| Taurocholic acid sodium salt hydrate | SIGMA | T4009-5G | |
| Tween-20 | Merck | 8221840500 | |
| Vectashield mounting agent | Vector Labs | H-1000 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries, Inc | SI0236 | |
| Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes) | Final amount | ||
| DMEM | Invitrogen | 12634-010 | 500ml |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| Glutamax | Gibco | 35050038 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| Hepes | Gibco | 15630056 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media) | Final concentration | ||
| A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 0.5µM |
| Adv+++ | make upto 100 ml | ||
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 1X |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50ng/mL |
| Gastrin | Tocris | 3006-1mg | 10 nM |
| NAC | Sigma | A9125-25G | 1.25mM |
| NIC | Sigma | N0636-100G | 10mM |
| Noggin CM | In house* | 10% | |
| P38 inhibitor (SB202190) | Sigma | S7076-25 mg | 10µM |
| PGE2 | Tocris | 2296/10 | 10 nM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1ml/500ml media |
| RSpoI CM | In house* | 20% | |
| Wnt3a CM | In house* | 50% | |
| In house* – cell lines will be provided upon request | |||
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media) | To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME) | ||
| LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media) | Final concentration | ||
| Adv+++ | make upto 100 ml | ||
| ALK-I A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 500nM |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 0.0763888889 |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100ng/ml |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 25ng/ml |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9125-25G | 1.25mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 5mM |
| Noggin UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| p38 MAPK-I | Sigma | S7076-25 mg | 1µM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1:500 |
| RhoKI Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817_100 mg | 2.5µm |
| Rspo UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection) | Final concentration | ||
| L-Glutathione reduced | Sigma | G4251-10MG | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Betaine | Sigma | 61962 | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| L-Cysteine | Sigma | 168149-2.5G | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Linoleic acid | Sigma | L1376-10MG | 6.8 μg/ml of OME/OMD /LOM |
| Taurine | Sigma | T0625-10MG | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Blocking buffer (for immunoflourescence staining) | Final concentration | ||
| Donkey/Goat serum | Bio-Rad | C06SB | 2% |
| PBS | Thermo-Fisher | 70011044 | Make upto 100ml |
| Tween 20 | Merck | P1379 | 0.1% |
| List of Antibodies used | |||
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Invitrogen | A-11011 | Dilution-1:500; RRID: AB_143157 |
| Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo | Waterborne, Inc | A400FLK | Dilution- 1:200 |
| Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive | Waterborne, Inc | IMS400-20 | Dilution-1:500 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Dilution-1:1000; RRID : AB_2629482 |
| Phalloidin-Alexa 674 | Invitrogen | A22287 | Dilution-1:1000; RRID: AB_2620155 |
| Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author). | Upon request | Upon request | Dilution-1:500 |
| Sporo-Glo | Waterborne, Inc | A600FLR-1X | Dilution- 1:200 |
References
- Checkley, W., et al. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium. The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).
- Bones, A. J., et al. Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research. Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).
- Muller, J., Hemphill, A. In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals. International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).
- Karanis, P., Aldeyarbi, H. M. Evolution of Cryptosporidium in vitro culture. International Journal for Parasitology. 41 (12), 1231-1242 (2011).
- Morada, M., et al. Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology. International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).
- DeCicco RePass, M. A., et al. Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum. Infection and Immunity. 85 (3), (2017).
- Miller, C. N., et al. A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology. International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modelling. bioRxiv. , (2018).
- Dutta, D., Clevers, H. Organoid culture systems to study host-pathogen interactions. Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- O’Hara, S. P., Chen, X. M. The cell biology of Cryptosporidium infection. Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).
- Lendner, M., Daugschies, A. Cryptosporidium infections: molecular advances. Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).
- Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells. Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).
- O’Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens. Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).
- Wilke, G., et al. Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro. mSphere. 3 (3), (2018).
- Vinayak, S., et al. Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum. Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
