Studerar Cryptosporidium infektion i 3D vävnad härledda humana Organoid kultur system genom microinjection
Summary
Vi beskriver protokoll för att förbereda oocyster och rena sporozoiter för att studera infektion av mänskliga tarm och luftvägarna organoider av Cryptosporidium parvum. Vi visar procedurerna för mikroinjektion av parasiter i tarmorganoid lumen och immunofärgning av organoider. Slutligen beskriver vi isoleringen av genererade oocyster från organoider.
Abstract
Cryptosporidium parvum är en av de viktigaste orsakerna till mänskliga diarrésjukdom. För att förstå parasitens patologi och utveckla effektiva läkemedel behövs ett in vitro-kultursystem som rekapitulerar förutsättningarna i värden. Organoider, som liknar vävnaderna i deras ursprung, är idealiska för att studera värd-parasit interaktioner. Organoider är tredimensionella (3D) vävnader härledda strukturer som härrör från vuxna stamceller och växa i kulturen under längre perioder utan att genomgå någon genetisk aberration eller omvandling. De har väl definierad polaritet med både apikala och basolaterala ytor. Organoider har olika tillämpningar inom drogtester, bio Banking, och sjukdomsmodellering och värd-Microbe interaktionsstudier. Här presenterar vi ett steg-för-steg-protokoll om hur man förbereder oocyster och sporozoiter av Cryptosporidium för att infektera mänskliga tarm och luftvägarna organoider. Vi visar sedan hur mikroinjektion kan användas för att injicera mikroberna i Organoid lumen. Det finns tre huvudsakliga metoder som organoider kan användas för värd-Microbe interaktionsstudier-mikroinjektion, mekanisk klippning och plätering, och genom att göra monolayers. Microinjection möjliggör underhåll av 3D-strukturen och möjliggör exakt kontroll av parasit volymer och direkt apikal sido kontakt för mikroberna. Vi tillhandahåller Detaljer för optimal tillväxt av organoider för antingen avbildning eller oocyster produktion. Slutligen visar vi också hur de nygenererade oocyster kan isoleras från Organoid för vidare nedströms bearbetning och analys.
Introduction
Utveckling av läkemedel eller vacciner för behandling och förebyggande av Kryptosporidium infektion har hindrats av avsaknaden av in vitro-system som exakt imiterar in vivo situationen hos människor1,2. Många av de för närvarande tillgängliga systemen antingen bara tillåter korttids infektion (< 5 dagar) eller inte stöder den kompletta livscykeln för parasiten3,4. Andra system som möjliggör en fullständig utveckling av parasiten är baserade på förevigade cellinjer eller cancer cellinjer som inte troget rekapitulera den fysiologiska situationen hos människor5,6,7 . Organoider eller “mini-organ” är 3D vävnad härledda strukturer som odlas i en extracellulär matris kompletteras med olika vävnads specifika tillväxtfaktorer. Organoider har utvecklats från olika organ och vävnader. De är genetiskt stabila och recapitulate mest fungerar av organen av deras beskärning, och kan underhållas i kultur för Extended perioder av tid. Vi har utvecklat en metod för att infektera mänskliga tarm och lung organoider med Cryptosporidium som ger en exakt in vitro-modell för studiet av värd-parasit interaktioner relevanta för intestinal och respiratorisk Cryptosporidios8 ,9,10,11,12,13. I motsats till andra publicerade kultur modeller, Organoid systemet är representativt förverkliga värden parasit interaktioner, gör det möjligt för slutförandet av livscykeln så att alla stadier av parasiten livscykel kan studeras, och upprätthåller parasiten förökning upp till 28 dagar10.
Cryptosporidium parvum är en parasit som infekterar epitelet i andnings-och tarm trakterna och orsakar långvarig diarrésjukdom. Den resistenta miljön skede är oocyst, finns i förorenad mat och vatten14. En gång intas eller inhaleras, den oocyster excystor och frigör fyra sporozoiter som fäster epitelceller. Sporozoiter glida på värdar celler och engagera värd cellreceptorer, men parasiten inte helt Invadera cellen, och verkar förmå värdcellen att uppslupa det15. Parasiten, som är internaliserad inom en intracellulär men extracytoplasmic facket, kvar på apikala ytan av cellen, replikerar inom en parasitophorous vacuole. Det genomgår två omgångar av asexuell reproduktion-en process som kallas merogony. Under merogony, typ I meronts utveckla som innehåller åtta merozoiter som släpps för att invadera nya celler. Dessa merozoiter invaderar nya celler för att utvecklas till typ II meronts som innehåller fyra merozoiter. Dessa merozoiter, när de släpps, infektera celler och utvecklas till macrogamonts och microgamonts. Microgametes släpps och befrukta macrogametes producerar zygoter som mognar till oocyster. Mogna oocyster släpps därefter ut i lumen. Oocyster är antingen tunnväggiga som omedelbart excysta att reinfektera epitelet, eller tjocka muromgärdade som släpps ut i miljön för att infektera nästa värd14. Alla stadier av Cryptosporidium livscykel har identifierats i Organoid kultur system som tidigare utvecklats av vår grupp10.
Eftersom humana organoider troget replikerar mänskliga vävnader9,11,13, och stödja alla replikativa stadier av Cryptosporidium10, de är det idealiska vävnadskultur system för att studera Cryptosporidium biologi och värd-parasit interaktioner. Här beskriver vi procedurerna för att infektera organoider med både Cryptosporidium -oocyster och excysted sporozoiter, och isolera de nya oocyster som produceras i detta vävnadskultur system.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kultur av Cryptosporidium parasiter i tarm och luftvägarna organoider ger en exakt modell för att studera värd-parasit interaktioner10 men har också många andra program. Till exempel, nuvarande metoder för att välja och sprida genetiskt modifierade Cryptosporidium parasiter kräver passage i möss19 som inte tillåter isolering av parasiter som har ändringar som är väsentliga för in vivo infektion. Organoid kultur av Cryptosporidium ger…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för Deborah A. Schaefer från School of Animal och komparativa biomedicinska vetenskaper, College of Agriculture och Life Sciences, University of Arizona, Tucson, AZ, USA för att hjälpa oss med oocyster produktion och analys. Vi tackar också Franceschi Microscopy och Imaging Center och D.L. Mullendore vid Washington State University för TEM beredning och avbildning av isolerade Organoid oocyster.
D.D. är mottagare av ett VENI-stipendium från den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO-ALW, 016. Veni. 171.015). I.H. är mottagare av ett VENI-stipendium från den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO-ALW, 863.14.002) och stöddes av Marie Curie-stipendier från Europeiska kommissionen (förslag 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). Forskningen som leder till dessa resultat har fått bidrag från Europeiska forskningsrådet under ERC Advanced Grant Agreement nr 67013 och från NIH NIAIH under R21 AT009174 till RMO. Detta arbete är en del av Oncode Institute, som delvis finansieras av det nederländska cancer sällskapet och finansierades av ett bidrag från det nederländska cancer sällskapet.
Materials
| Basement membrane extract (extracellular matrix) | amsbio | 3533-010-02 | |
| Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody) | Waterborne, Inc | A400FLR-1X | Final Concentration = Use 2-3 drops/slide |
| Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads | Waterborne, Inc | IMS400-20 | |
| Dynamag 15 rack | Thermofisher Scientific | 12301D | |
| Dynamag 2 rack | Thermofisher Scientific | 12321D | |
| EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µm | EMD-Millipore | TSTP02500 | |
| Fast green dye | SIGMA | F7252-5G | |
| Femtojet 4i Microinjector | Eppendorf | 5252000013 | |
| Glass capillaries of 1 mm diameter | WPI | TW100F-4 | |
| Matrigel (extracellular matrix) | Corning | 356237 | |
| Microfuge tube 1.5ml | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Micro-loader tips | Eppendorf | 612-7933 | |
| Micropipette puller P-97 | Shutter instrument | P-97 | |
| Normal donkey Serum | Bio-Rad | C06SB | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium hypoclorite (use 5%) | Clorox | 50371478 | |
| Super stick slides | Waterborne, Inc | S100-3 | |
| Swinnex-25 47mm Polycarbonate filter holder | EMD-Millipore | SX0002500 | |
| Taurocholic acid sodium salt hydrate | SIGMA | T4009-5G | |
| Tween-20 | Merck | 8221840500 | |
| Vectashield mounting agent | Vector Labs | H-1000 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries, Inc | SI0236 | |
| Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes) | Final amount | ||
| DMEM | Invitrogen | 12634-010 | 500ml |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| Glutamax | Gibco | 35050038 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| Hepes | Gibco | 15630056 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media) | Final concentration | ||
| A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 0.5µM |
| Adv+++ | make upto 100 ml | ||
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 1X |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50ng/mL |
| Gastrin | Tocris | 3006-1mg | 10 nM |
| NAC | Sigma | A9125-25G | 1.25mM |
| NIC | Sigma | N0636-100G | 10mM |
| Noggin CM | In house* | 10% | |
| P38 inhibitor (SB202190) | Sigma | S7076-25 mg | 10µM |
| PGE2 | Tocris | 2296/10 | 10 nM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1ml/500ml media |
| RSpoI CM | In house* | 20% | |
| Wnt3a CM | In house* | 50% | |
| In house* – cell lines will be provided upon request | |||
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media) | To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME) | ||
| LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media) | Final concentration | ||
| Adv+++ | make upto 100 ml | ||
| ALK-I A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 500nM |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 0.0763888889 |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100ng/ml |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 25ng/ml |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9125-25G | 1.25mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 5mM |
| Noggin UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| p38 MAPK-I | Sigma | S7076-25 mg | 1µM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1:500 |
| RhoKI Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817_100 mg | 2.5µm |
| Rspo UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection) | Final concentration | ||
| L-Glutathione reduced | Sigma | G4251-10MG | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Betaine | Sigma | 61962 | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| L-Cysteine | Sigma | 168149-2.5G | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Linoleic acid | Sigma | L1376-10MG | 6.8 μg/ml of OME/OMD /LOM |
| Taurine | Sigma | T0625-10MG | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Blocking buffer (for immunoflourescence staining) | Final concentration | ||
| Donkey/Goat serum | Bio-Rad | C06SB | 2% |
| PBS | Thermo-Fisher | 70011044 | Make upto 100ml |
| Tween 20 | Merck | P1379 | 0.1% |
| List of Antibodies used | |||
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Invitrogen | A-11011 | Dilution-1:500; RRID: AB_143157 |
| Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo | Waterborne, Inc | A400FLK | Dilution- 1:200 |
| Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive | Waterborne, Inc | IMS400-20 | Dilution-1:500 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Dilution-1:1000; RRID : AB_2629482 |
| Phalloidin-Alexa 674 | Invitrogen | A22287 | Dilution-1:1000; RRID: AB_2620155 |
| Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author). | Upon request | Upon request | Dilution-1:500 |
| Sporo-Glo | Waterborne, Inc | A600FLR-1X | Dilution- 1:200 |
References
- Checkley, W., et al. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium. The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).
- Bones, A. J., et al. Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research. Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).
- Muller, J., Hemphill, A. In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals. International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).
- Karanis, P., Aldeyarbi, H. M. Evolution of Cryptosporidium in vitro culture. International Journal for Parasitology. 41 (12), 1231-1242 (2011).
- Morada, M., et al. Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology. International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).
- DeCicco RePass, M. A., et al. Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum. Infection and Immunity. 85 (3), (2017).
- Miller, C. N., et al. A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology. International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modelling. bioRxiv. , (2018).
- Dutta, D., Clevers, H. Organoid culture systems to study host-pathogen interactions. Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- O’Hara, S. P., Chen, X. M. The cell biology of Cryptosporidium infection. Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).
- Lendner, M., Daugschies, A. Cryptosporidium infections: molecular advances. Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).
- Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells. Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).
- O’Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens. Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).
- Wilke, G., et al. Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro. mSphere. 3 (3), (2018).
- Vinayak, S., et al. Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum. Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
