Het onthullen van Hemolymph inzameling en inenting van anisopliae Blastospores in Rhipicephalus Microplus teken naar ongewervelde pathologie studies
Summary
Analyse van Tick hemolymph vertegenwoordigt een belangrijke bron van informatie over hoe sommige ziekteverwekkers ziekte veroorzaken en hoe teken immunologisch reageren op deze infectie. De huidige studie toont aan hoe inoculeren schimmel propagulen en het verzamelen van hemolymph van Rhipicephalus Microplus engorged vrouwtjes.
Abstract
Teken zijn verplicht bloedzuigende ectoparasieten en Rhipicephalus Microplus heeft groot belang in de veterinaire geneeskunde, omdat het veroorzaakt bloedarmoede, gewichtsverlies, afschrijving van de dieren ‘ leer en kan ook fungeren als een vector van verschillende pathogenen. Wegens de exorbitante kosten om deze parasieten te controleren, schade aan het milieu dat door het ongepaste gebruik van chemische acariciden wordt veroorzaakt, en de verhoogde weerstand tegen traditionele parasieten bestrijdingsmiddelen uit, alternatieve controle van tikken, door het gebruik van entomopathogene schimmels, bijvoorbeeld, is beschouwd als een interessante aanpak. Niettemin, hebben weinig studies aangetoond hoe het immuunsysteem van de Tik handelt om deze entomopathogens te bestrijden. Daarom demonstreert dit protocol twee methodes die voor entomopathogen inenting in engorged wijfjes en twee technieken worden gebruikt die voor hemolymph inzameling en hemocytes het oogsten worden gebruikt. Inenting van ziekteverwekkers bij de been toevoeging in het lichaam van de Tik wijfje laat evaluatie van wijfjes biologische parameters in tegenstelling tot de inenting tussen Scutum en capitulum, die vaak Gené’s orgaan beschadigen. Dorsale hemolymph collectie leverde een hoger volumeherstel dan de collectie door de benen. Enkele beperkingen van Tick hemolymph verzameling en verwerking omvatten i) hoge tarieven van hemocytes ‘ verstoring, II) hemolymph besmetting met verstoorde middendarm, en III) lage hemolymph volumeherstel. Wanneer hemolymph wordt verzameld door het been snijden, de hemolymph kost tijd om zich ophopen op het been opening, ten gunste van de stollingsproces. Bovendien worden in de collectie via het been minder hemocytes verkregen in vergelijking met de dorsale collectie, ook al wordt de eerste methode als gemakkelijker uitgevoerd. Inzicht in het immuunsysteem reactie in teken bemiddeld door entomopathogene agenten helpt om hun pathogenese onthullen en ontwikkelen van nieuwe doelen voor Tick Control. De hier beschreven inentings processen vereisen zeer lage technologische middelen en kunnen niet alleen worden gebruikt om teken aan pathogene micro-organismen bloot te stellen. Evenzo kan de collectie van Tick hemolymph vertegenwoordigen de eerste stap voor veel fysiologische studies.
Introduction
Het vee Tick, Rhipicephalus Microplus, is een Hematophagus ectoparasite met een enorme negatieve invloed op de veestapel in tropische gebieden. Deze teek is de vector van pathogene agentia zoals Babesia bovis, Babesia Bigemina, en Anaplasma marginale dat, in combinatie met de directe hemofeeding schade, kan verminderen melk en vleesproductie, bloedarmoede veroorzaken en uiteindelijk de dood. De verliezen die door dit ectoparasite worden veroorzaakt werden geschat in 3.240.000.000 dollars jaarlijks in Brazilië1. Er worden duurzame methoden geëist en het gebruik van entomopathogene middelen wordt beschouwd als een veelbelovend alternatief om het gebruik van chemische acariciden2,3,4te verminderen.
Entomopathogene schimmels, zoals anisopliae spp., zijn natuurlijke vijanden van geleedpotigen met inbegrip van teken, en sommige isolaten kunnen worden gebruikt als biocontroller. Deze pathogenen infecteren actief de gastheer door de cuticula en koloniseren hun lichaam2,5,6. Naarmate de infectie zich ontwikkelt, cellulaire en humorale reacties worden bemiddeld door de teek immuunsysteem. Analyse van de teek hemolymph wordt gerapporteerd als een nuttig instrument om het immuunsysteem reacties na de uitdagende met pathogenen7,8te evalueren.
De immune reactie van geleedpotigen is verdeeld in humorale en cellulaire reacties. De humorale reactie betreft hemagglutination processen en de productie van antimicrobiële eiwitten/peptiden, terwijl de cellulaire immuunrespons wordt uitgevoerd door de hemocytes. Deze cellen zijn aanwezig in de hemolymph van alle geleedpotigen en worden gerapporteerd aan een expressieve rol in studies met innate immune response9te ontwikkelen, want het is direct gerelateerd aan de fagocytose en inkapseling processen. Dienovereenkomstig, kunnen de studies over hemocytes helpen om doods weg te onderzoeken en processen zoals autophagy, apoptosis, en necrose te begrijpen. In sommige ongewervelden als tweekleppigen, de hemocytes ‘ collectie gezichten beperkingen zoals cel verstoring, lage hemolymph volume verkregen, en lage concentratie van teruggewonnen cellen10. Zeer vaak, afhankelijk van de toegepaste methodologie, verminderde concentratie van cellen wordt verkregen, invloed rechtstreeks op de cellen kwantificering en analyse.
Het aantal hemocytes dat in hemolymph circuleert is veranderlijk onder verschillende geleedpotigen en het kan in de zelfde soort veranderen toe te schrijven aan verschillende fysiologische stadia zoals geslacht, leeftijd, en ontwikkelingsstadium11van de geleedpotige. Hemocytes kan ook worden gevonden gerespecteerd voor sommige organen en worden vrijgegeven in het verkeer net na de infectie proces11. Niettemin, rapporteerden de meeste studies gebruik insecten, terwijl de tikken minder onderzocht betreffende hun fysiologie en pathologie blijven. Ondanks pathogeen inenting en hemolymph collectie in teken zijn minder gebruikte technieken, het vaststellen van standaard methoden helpt de ontwikkeling van meer accurate studies.
Het doel van deze studie was het vergelijken van de meest gebruikte methoden voor hemolymph inzameling en inenting van pathogenen in R. Microplus teken, het evalueren van de werkzaamheid in de hemolymph acquisitie en hemocytes concentratie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Inenting van ziekteverwekkers is nuttig wanneer de studie poogt de in vivo actie van micro-organismen in experimentele geleedpotige modellen te onderzoeken omdat het verzekert dat de ziekteverwekker binnen de gastheer is. De techniek kan ook worden toegepast op inoculeren moleculen zoals RNA interferentie (RNAi). De inenting tussen Scutum en capitulum wordt beschouwd als gemakkelijker uit te voeren maar vaak beschadigt Gené’s orgaan, dat de eieren levensvatbaarheid12,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd deels gefinancierd door de Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoaal de nível Superior (CAPEs) uit Brazilië, Finance code 001. CAPEs mits Ph.D. Scholarship voor A.F. Marciano. Wij danken de nationale Raad voor wetenschappelijke en technologische ontwikkeling (CNPq) van Brazilië voor het verstrekken van Ph.D. beurs voor J. Fiorotti. Dit onderzoek werd ook ondersteund door subsidies van Carlos Chagas Filho Stichting voor onderzoek van de staat Rio de Janeiro (FAPERJ) en CNPq. V.R.E.P. Bittencourt is een CNPq onderzoeker.
Materials
| Alkaline Hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | A1727 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| EDTA | Synth | 2706 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000036 | |
| Flexible rubber | BD | ||
| Giemsa stain | Sigma-Aldrich | 48900-500ML-F | |
| Glass capillary | CTechGlass | CT95-02 | |
| Insulin syringe (needle) | BD | SKU: 324910 | |
| KH2PO4 | Vetec | 60REAVET014512 | |
| Leibovitz's L-15 culture medium | Gibco | 11415-064 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| Microscope slides | Kasvi | K5-7105 | |
| Microtubes | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Na2HPO4 | Vetec | 60REAVET014593 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0111 | |
| Penicillin | Gibco | 15140163 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 |
References
- Grisi, L., et al. Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).
- Schrank, A., Vainstein, M. H. Metarhizium anisopliae enzymes and toxins. Toxicon. 56 (7), 1267-1274 (2010).
- Camargo, M. G., et al. Metarhizium anisopliae for controlling Rhipicephalus microplus ticks under field conditions. Veterinary Parasitology. 223, 38-42 (2016).
- Perinotto, W. M. S., et al. In vitro pathogenicity of different Metarhizium anisopliae s.l. isolates in oil formulations against Rhipicephalus microplus. Biocontrol Science and Technology. 27 (3), 338-347 (2017).
- Pedrini, N., Crespo, R., Juarez, M. P. Biochemistry of insect epicuticle degradation by entomopathogenic fungi. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology and Pharmacolpgy. 146 (1-2), 124-137 (2007).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the surface: Entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4 (3), 357-374 (2013).
- Angelo, I. C., et al. Detection of serpins involved in cellular immune response of Rhipicephalus microplus challenged with fungi. Biocontrol Science and Technology. 24 (3), 351-360 (2014).
- De Paulo, J. F., et al. Rhipicephalus microplus infected by Metarhizium: unveiling hemocyte quantification, GFP-fungi virulence, and ovary infection. Parasitology Research. 117, 1847-1856 (2018).
- Marmaras, V. J., Lampropoulou, M. Regulators and signalling in insect haemocyte immunity. Cell Signal. 21, 186-195 (2009).
- Hinzmann, M. F., Lopes-Lima, M., Gonçalves, J., Machado, J. Antiaggregant and toxic properties of different solutions on hemocytes of three freshwater bivalves. Toxicological & Environmental Chemistry. 95, 790-805 (2013).
- Nation, J. L. . Insect Physiology and Biochemistry. , (2016).
- Gene, J. Mémoires de l’Académie royale des sciences. Torino. 9, 751 (1848).
- Lees, A. D., Beament, J. W. L. An organ waxing in ticks. The Quarterly Journal of the Mythic Society. 7, 291-332 (1948).
- Sonenshine, D. E., Roe, R. M. . Biology of ticks. , (2014).
- Tan, J., et al. Characterization of hemocytes proliferation in larval silkworm Bombyx mori. Journal of Insect Physiology. 59 (6), 595-603 (2013).
- Bowden, T. J. The humoral immune systems of the American lobster (Homarus americanus) and the European lobster (Homarus gammarus). Fish Research. 186, 367-371 (2017).
- Sonenshine, D. E., Hynes, W. L. Molecular characterization and related aspects of the innate immune response in ticks. Frontiers in Bioscience. 13, 7046-7063 (2008).
- Tsakas, S., Marmaras, V. Insect immunity and its signaling: an overview. Invertebrate Survival Journal. 7, 228-238 (2010).
- Burgdorfer, W. Hemolymph Test. A technique for detection of Rickettsiae in ticks. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 19, 1010-1014 (1970).
- Dunham-Ems, S. M., et al. Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks. Journal of Clinical Investigation. 119, 3652-3665 (2009).
- Patton, T. G., et al. Saliva, salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. 60, e3894 (2012).
