Divulgar la colección hemolymph y la inoculación de Metarhizium blastosporos en las garrapatas de rhipicephalus microplus hacia los estudios de patología de invertebrados
Summary
El análisis de la hemolinfa de garrapata representa una importante fuente de información sobre cómo algunos patógenos causan enfermedades y cómo las garrapatas responden inmunológicamente a esta infección. El presente estudio demuestra cómo inocular propágulos fúngicos y recolectar hemolinfa de las hembras engorgadas de rhipicephalus microplus .
Abstract
Las garrapatas son ectoparásitos hematóviles obligados y rhipicephalus microplus tiene una gran importancia en la medicina veterinaria porque causa anemia, pérdida de peso, depreciación del cuero de los animales y también puede actuar como un vector de varios patógenos. Debido a los costos exorbitantes para controlar estos parásitos, daños al medio ambiente causados por el uso inadecuado de acaricidas químicos, y el aumento de la resistencia contra los parasiticidas tradicionales, control alternativo de las garrapatas, mediante el uso de hongos entomopatógenos, por ejemplo, se ha considerado un enfoque interesante. Sin embargo, pocos estudios han demostrado cómo el sistema inmunológico de la garrapata actúa para luchar contra estos entomopatógenos. Por lo tanto, este protocolo demuestra dos métodos utilizados para la inoculación de entomopatógenos en hembras engorgadas y dos técnicas utilizadas para la recolección de hemológeno y la cosecha de hemocitos. La inoculación de patógenos en la inserción de la pierna en el cuerpo de la hembra de la garrapata permite la evaluación de los parámetros biológicos de las hembras a diferencia de la inoculación entre el Scutum Logistic y el capitulum, que con frecuencia daña el órgano de Genéu. La colección de hemolinfa dorsal produjo una recuperación de mayor volumen que la recogida a través de las piernas. Algunas limitaciones de la recolección y procesamiento de hemolinfa de garrapata incluyen i) altas tasas de alteración de los hemocitos, II) contaminación de la hemolafila con alteraciones en el intestino medio, y III) baja recuperación del volumen de hemolh. Cuando la hemolinfa se recoge a través del corte de la pierna, la hemoléh tarda en acumularse en la abertura de la pierna, favoreciendo el proceso de coagulación. Además, se obtienen menos hemocitos en la colección a través de la pierna en comparación con la colección dorsal, a pesar de que el primer método se considera más fácil de realizar. La comprensión de la respuesta inmune en las garrapatas mediadas por agentes entomopatógenos ayuda a revelar su patogénesis y desarrollar nuevos objetivos para el control de la garrapata. Los procesos de inoculación aquí descritos requieren muy bajos recursos tecnológicos y se pueden utilizar no sólo para exponer las garrapatas a microorganismos patógenos. Del mismo modo, la colección de la hemolafila de garrapata puede representar el primer paso para muchos estudios fisiológicos.
Introduction
La garrapata del ganado, rhipicephalus microplus, es un ectoparásito hematófago con un enorme impacto negativo en el ganado en las zonas tropicales. Esta garrapata es el vector de agentes patógenos como Babesia bovis, Babesia bigemina, y ANAPLASMA MARGINALE que, combinados con el daño de hemofeeding directo, pueden reducir la producción de leche y carne, causar anemia y finalmente la muerte. Las pérdidas causadas por este ectoparásito se calcularon en 3,24 mil millones dólares anualmente en Brasil1. Se exigen métodos sostenibles y el uso de agentes entomopatógenos se considera una alternativa prometedora para reducir el uso de acaricidas químicos2,3,4.
Los hongos entomopatógenos, como Metarhizium spp., son enemigos naturales de los artrópodos, incluidas las garrapatas, y algunos aislados pueden utilizarse como biocontroladores. Estos patógenos infectan activamente al huésped a través de la cutícula y colonizan su cuerpo2,5,6. A medida que la infección se desarrolla, las respuestas celulares y humorales son mediadas por el sistema inmunológico de la garrapata. El análisis de la garrapata hemolinfa se divulga como una herramienta útil para evaluar las respuestas inmunitarias después del reto con patógenos7,8.
La respuesta inmunitaria de los artrópodos se divide en respuestas humorales y celulares. La respuesta humoral consiste en procesos de hemaglutinación y producción de proteínas/péptidos antimicrobianos, mientras que la respuesta inmunitaria celular se realiza a través de los hemocitos. Estas células están presentes en la hemolinfa de todos los artrópodos y se reportan para desarrollar un papel expresivo en los estudios que implican la respuesta inmune innata9, ya que está directamente relacionado con los procesos de phagocitosis y encapsulación. En consecuencia, los estudios sobre los hemocitos pueden ayudar a investigar la vía de la muerte y comprender procesos como la autofagia, la apoptosis y la necrosis. En algunos invertebrados como bivalvos, la colección de los hemocitos se enfrenta a limitaciones como la alteración celular, el volumen bajo de hemolécula obtenida y la baja concentración de células recuperadas10. Con mucha frecuencia, dependiendo de la metodología aplicada, se obtiene una concentración reducida de células, afectando directamente a la cuantificación y análisis de las células.
El número de hemocitos circulantes en la hemolafila es variable entre los diferentes artrópodos y puede cambiar en la misma especie debido a diferentes etapas fisiológicas como el sexo, la edad, y la etapa de desarrollo del artrópodo11. Los hemocitos también se pueden encontrar adherida a algunos órganos y se liberan en la circulación justo después del proceso de infección11. Sin embargo, la mayoría de los estudios informaron utilizar insectos, mientras que las garrapatas siguen siendo menos exploradas con respecto a su fisiología y patología. A pesar de la inoculación de patógenos y la recolección de hemolinfa en garrapatas son técnicas menos utilizadas, el establecimiento de métodos estándar ayuda al desarrollo de estudios más precisos.
El objetivo del presente estudio fue comparar los métodos más utilizados para la recolección de hemolinfa y la inoculación de patógenos en garrapatas R. microplus , evaluando la eficacia de la adquisición de hemolágenos y la concentración de hemocitos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La inoculación de patógenos es útil cuando el estudio tiene como objetivo investigar la acción in vivo de microorganismos en modelos de artrópodos experimentales porque asegura que el patógeno está dentro del huésped. La técnica también se puede aplicar para inocular moléculas como la interferencia de ARN (ARNi). La inoculación entre el Scutum Logistic y el capitulum se considera más fácil de llevar a cabo, pero con frecuencia daña el órgano de Genée deteriorar la viabilidad de los óvulos<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue financiado en parte por el Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de nível superior (CAPES) de Brasil, código de finanzas 001. La CAPES proporcionó una beca de doctorado para A.F. Marciano. Agradecemos al Consejo Nacional de desarrollo científico y tecnológico (CNPq) de Brasil por proporcionar una beca de doctorado para J. Fiorotti. Esta investigación también fue apoyada por becas de la Fundación Carlos Chagas Filho para la investigación del estado de Río de Janeiro (FAPERJ) y CNPq. V.R.E.P. Bittencourt es un investigador CNPq.
Materials
| Alkaline Hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | A1727 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| EDTA | Synth | 2706 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000036 | |
| Flexible rubber | BD | ||
| Giemsa stain | Sigma-Aldrich | 48900-500ML-F | |
| Glass capillary | CTechGlass | CT95-02 | |
| Insulin syringe (needle) | BD | SKU: 324910 | |
| KH2PO4 | Vetec | 60REAVET014512 | |
| Leibovitz's L-15 culture medium | Gibco | 11415-064 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| Microscope slides | Kasvi | K5-7105 | |
| Microtubes | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Na2HPO4 | Vetec | 60REAVET014593 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0111 | |
| Penicillin | Gibco | 15140163 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 |
References
- Grisi, L., et al. Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).
- Schrank, A., Vainstein, M. H. Metarhizium anisopliae enzymes and toxins. Toxicon. 56 (7), 1267-1274 (2010).
- Camargo, M. G., et al. Metarhizium anisopliae for controlling Rhipicephalus microplus ticks under field conditions. Veterinary Parasitology. 223, 38-42 (2016).
- Perinotto, W. M. S., et al. In vitro pathogenicity of different Metarhizium anisopliae s.l. isolates in oil formulations against Rhipicephalus microplus. Biocontrol Science and Technology. 27 (3), 338-347 (2017).
- Pedrini, N., Crespo, R., Juarez, M. P. Biochemistry of insect epicuticle degradation by entomopathogenic fungi. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology and Pharmacolpgy. 146 (1-2), 124-137 (2007).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the surface: Entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4 (3), 357-374 (2013).
- Angelo, I. C., et al. Detection of serpins involved in cellular immune response of Rhipicephalus microplus challenged with fungi. Biocontrol Science and Technology. 24 (3), 351-360 (2014).
- De Paulo, J. F., et al. Rhipicephalus microplus infected by Metarhizium: unveiling hemocyte quantification, GFP-fungi virulence, and ovary infection. Parasitology Research. 117, 1847-1856 (2018).
- Marmaras, V. J., Lampropoulou, M. Regulators and signalling in insect haemocyte immunity. Cell Signal. 21, 186-195 (2009).
- Hinzmann, M. F., Lopes-Lima, M., Gonçalves, J., Machado, J. Antiaggregant and toxic properties of different solutions on hemocytes of three freshwater bivalves. Toxicological & Environmental Chemistry. 95, 790-805 (2013).
- Nation, J. L. . Insect Physiology and Biochemistry. , (2016).
- Gene, J. Mémoires de l’Académie royale des sciences. Torino. 9, 751 (1848).
- Lees, A. D., Beament, J. W. L. An organ waxing in ticks. The Quarterly Journal of the Mythic Society. 7, 291-332 (1948).
- Sonenshine, D. E., Roe, R. M. . Biology of ticks. , (2014).
- Tan, J., et al. Characterization of hemocytes proliferation in larval silkworm Bombyx mori. Journal of Insect Physiology. 59 (6), 595-603 (2013).
- Bowden, T. J. The humoral immune systems of the American lobster (Homarus americanus) and the European lobster (Homarus gammarus). Fish Research. 186, 367-371 (2017).
- Sonenshine, D. E., Hynes, W. L. Molecular characterization and related aspects of the innate immune response in ticks. Frontiers in Bioscience. 13, 7046-7063 (2008).
- Tsakas, S., Marmaras, V. Insect immunity and its signaling: an overview. Invertebrate Survival Journal. 7, 228-238 (2010).
- Burgdorfer, W. Hemolymph Test. A technique for detection of Rickettsiae in ticks. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 19, 1010-1014 (1970).
- Dunham-Ems, S. M., et al. Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks. Journal of Clinical Investigation. 119, 3652-3665 (2009).
- Patton, T. G., et al. Saliva, salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. 60, e3894 (2012).
