Die Sammlung der Häkolymphe und die Inokulation von Metarhizium-Blastospores in Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Pathology Studies
Summary
Die Analyse der Zeckenhemolymphe stellt eine wichtige Quelle für Informationen darüber dar, wie einige Krankheitserreger verursachen und wie Zecken immunologisch auf diese Infektion reagieren. Die vorliegende Studie zeigt, wie man Pilzpropagiolen impfen und die Hämatymphe von Rhipicephalus microplus verzierten Weibchen sammeln kann.
Abstract
Zecken sind obligatorische hämatopophagöse Ektoparasiten und Rhipicephalus microplus hat eine große Bedeutung in der Veterinärmedizin, weil es Anämie, Gewichtsverlust, Abwertung des Gelders der Tiere verursacht und auch als Vektor von mehreren Krankheitserregern wirken kann. Aufgrund der exorbitanten Kosten für die Kontrolle dieser Parasiten, der Umweltschäden, die durch den unangemessenen Einsatz chemischer Akarzide verursacht werden, und der erhöhten Resistenz gegen traditionelle Parasitizide, der alternativen Kontrolle von Zecken, durch den Einsatz von Entomopathogene Pilze etwa wurden als interessanter Ansatz angesehen. Dennoch haben nur wenige Studien gezeigt, wie das Immunsystem der Zecke gegen diese Entomopathogene wirkt. Daher zeigt dieses Protokoll zwei Methoden, die zur Entomopathogen-Impfung in engormierte Frauen verwendet werden, und zwei Techniken, die für die Hämatolymphentnahme und die Ernte von Hämozyten verwendet werden. Die Inokulation von Krankheitserregern an der Beineinfügung in den Körper der Zecke ermöglicht die Bewertung von weiblichen biologischen Parametern im Gegensatz zur Impfung zwischen dem Sutum und dem Kapitulum, die häufig das Organ von Gené schädigt. Die Dorsal-Hämatymphe gab eine höhere Erholung als die Sammlung durch die Beine. Einige Einschränkungen der Zeckenhemolymphentnahme und-verarbeitung sind i) hohe Raten der Hämozyten-Störung, ii) Hämatolymphkontamination mit gestörtem Midgut, und iii) niedrige Hämatolymphen-Volumen-Erholung. Wenn die Hämatymphe durch den Beinschnitt gesammelt wird, braucht die Hämatymphe Zeit, um sich an der Beinöffnung zu sammeln, was den Gerinnungsprozess begünstigt. Darüber hinaus werden im Vergleich zur Rückensammlung weniger Hämozyten in der Sammlung durch das Bein gewonnen, obwohl die erste Methode als leichter durchzuführen gilt. Das Verständnis der Immunantwort in Zecken durch entomopathogene Wirkstoffe vermittelt hilft, ihre Pathogenese zu enthüllen und neue Ziele für die Zeckenkontrolle zu entwickeln. Die hier beschriebenen Impfprozesse erfordern sehr geringe technologische Ressourcen und können nicht nur zur Exposition von Zecken für pathogene Mikroorganismen eingesetzt werden. In ähnlicher Weise kann die Sammlung von Zeckenhemolymphe den ersten Schritt für viele physiologische Studien darstellen.
Introduction
Die Rinderzecke, Rhipicephalus microplus,ist ein Hämatophait-Ektoparasit mit enormen negativen Auswirkungen auf die Tiere in tropischen Gebieten. Diese Zecke ist der Vektor von Krankheitserregern wie Babesiabovis, Babesia bigeminaund Anaplasma marginale , die in Kombination mit den direkten Hämorschäden, die Milch-und Fleischproduktion, Anämie und schließlich den Tod reduzieren können. Die Verluste, die durch diesen Ektoparasiten verursachtwurden, wurden in Brasilien jährlich auf 3,24 Milliarden Dollar geschätzt. Nachhaltige Methoden werden gefordert und der Einsatz von entomopathogenen Wirkstoffen gilt als vielversprechende Alternative, um den Einsatz von chemischen Akarziden 2,3,4zu reduzieren.
Entomopathogene Pilze, wie Metarhizium spp., sind natürliche Feinde von Arthropoden einschließlich Zecken, und einige Isolate können als Biocontroller verwendet werden. Diese Erreger infizieren den Wirt aktiv durch die Kutikel und kolonisieren ihren Körper2,5,6. Im Zuge der Entwicklung der Infektion werden zelluläre und humorale Reaktionen durch das Zeckenimmunsystem vermittelt. Die Analyse der Zecke Hämata wird als ein nützliches Werkzeug zur Bewertung der Immunreaktionen nach der Herausforderung mit Krankheitserregern7,8berichtet.
Arthropods Immunantwort ist in humorale und zelluläre Reaktionen unterteilt. Die humorale Reaktion beinhaltet Hämoroperationen und die Produktion von antimikrobiellen Proteins-/Peptiden, während die zelluläre Immunantwort durch die Hämozyten erfolgt. Diese Zellen sind in der Hämatymphe von allen Arthropoden vorhanden und werden berichtet, um eine ausdrucksstarke Rolle in Studien mit angeborenen Immunantwort9 zuentwickeln, da es direkt mit der Phagozytose und Verkapselung. Demnach können Studien über Hämozyten helfen, den Todesweg zu untersuchen und Prozesse wie Autophagie, Apoptose und Nekrose zu verstehen. Bei einigen Wirbellosen als Zweiventile sieht sich die Sammlung der Hämozyten mit Einschränkungen konfrontiert, wie Zellstörungen, niedrigem Hemolymphvolumen und geringer Konzentration der wiedergewonnenen Zellen10. Sehr häufig, je nach angewandter Methodik, wird eine reduzierte Konzentration der Zellen erreicht, die sich direkt auf die Quantifizierung und Analyse der Zellen auswirkt.
Die Anzahl der Hämozyten, die in der Hämatymphe zirkulieren, ist unter den verschiedenen Arthropoden variabel und kann sich in der gleichen Art aufgrund verschiedener physiologischer Stadien wie Geschlecht, Alter und Entwicklungsstufe 11 des Arthropods verändern. Hanzyten können auch an einigen Organen haften und kurz nach dem Infektionsprozess 11 in den Kreislaufentlassenwerden. Dennoch werden die meisten Studien mit Insekten beschäftigt, während Zecken in Bezug auf ihre Physiologie und Pathologie weniger erforscht sind. Trotz der Paarungs-Impfung und Hämatolymphentnahme in Zecken sind weniger verwendet Techniken, die Etablierung von Standardmethoden hilft bei der Entwicklung von genaueren Studien.
Ziel der vorliegenden Studie war es, die am häufigsten verwendeten Methoden zur Hämatolymphentnahme und Impfung von Krankheitserregern in R. Microplus-Zecken zu vergleichen und dabei die Wirksamkeit bei der Hämatolymphenerfassung und der Hämozytenkonzentration zu bewerten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Nachahmung von Krankheitserregern ist nützlich, wenn die Studie darauf abzielt, die In-vivo-Wirkung von Mikroorganismen in experimentellen Arthropodenmodellen zu untersuchen, da sie sicherstellt, dass sich der Erreger im Inneren des Wirts befindet. Die Technik kann auch auf Impfungen wie RNA-Interferenzen (RNAi) angewendet werden. Die Inokulation zwischen dem Skutum und dem Kapitulum wird als leichter zu erbringen angesehen, schädigt aber häufig das Organ von Gené,wasdie Lebensfähigkeit<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde zum Teil von der Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) aus Brasilien, Finanzcode 001, finanziert. CAPES vergab ein Doktorandenstipendium für A.F. Marciano. Wir danken dem Nationalen Rat für wissenschaftliche und technologische Entwicklung (CNPq) Brasiliens für die Bereitstellung von Promotionsstipendien für J. Fiorotti. Diese Forschung wurde auch durch Stipendien der Carlos Chagas Filho Foundation for Research of the State of Rio de Janeiro (FAPERJ) und CNPq unterstützt. V.R.E.P. Bittencourt ist CNPq-Forscher.
Materials
| Alkaline Hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | A1727 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| EDTA | Synth | 2706 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000036 | |
| Flexible rubber | BD | ||
| Giemsa stain | Sigma-Aldrich | 48900-500ML-F | |
| Glass capillary | CTechGlass | CT95-02 | |
| Insulin syringe (needle) | BD | SKU: 324910 | |
| KH2PO4 | Vetec | 60REAVET014512 | |
| Leibovitz's L-15 culture medium | Gibco | 11415-064 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| Microscope slides | Kasvi | K5-7105 | |
| Microtubes | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Na2HPO4 | Vetec | 60REAVET014593 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0111 | |
| Penicillin | Gibco | 15140163 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 |
References
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