בגילוי המוליל אוסף והחיסונים של מטרהיזיפיאוס לתוך ריפיקו מיקרופלוס קרציות לקראת לימודי חסרי חוליות פתולוגיה
Summary
ניתוח של שנתות המוליקמ מייצג מקור חשוב של מידע על איך כמה פתוגנים לגרום למחלה וכיצד קרציות מגיבים באופן חיסוני לזיהום זה. המחקר הנוכחי מדגים כיצד לחסן מפיץ פטרייתי ולאסוף המוליםקמ מ הנשים המנוסות מיקרופיאוס .
Abstract
קרציות הם מחייבים המטפנים ectop, ו המיקרופיקאוס מיקרופלוס יש חשיבות רבה ברפואה וטרינרית כי זה גורם לאנמיה, ירידה במשקל, פחת של עור בעלי חיים גם יכול לשמש וקטור של מספר פתוגנים. בשל העלויות הכרוכות בשליטה בטפילים אלה, נזק לסביבה הנגרמת על ידי שימוש לא הולם בחומר הדברה כימי, והתנגדות מוגברת נגד פרזיטים מסורתיים, שליטה אלטרנטיבית על קרציות, על ידי שימוש ב הפטריות הentomopathogenic, למשל, נחשבה לגישה מעניינת. עם זאת, מחקרים מעטים הוכיחו כיצד המערכת החיסונית של הקרצייה פועל כדי להילחם אלה entomopathogens. לפיכך, פרוטוקול זה מדגים שתי שיטות המשמשות לentomopathogen חיסונים לנקבות מנוגנות ושתי טכניקות המשמשות עבור אוסף המוליש וקצירת הומוציטים. החיסונים של פתוגנים בכניסה לרגל בגוף של שנתות הנשי מאפשר הערכה של הנשים פרמטרים ביולוגיים בניגוד החיסון בין scuulum לבין הקפיאולום, אשר לעתים קרובות לנזק עוגב של ג ‘ ו. מעבר לאוסף באמצעות הרגליים הניב התאוששות בנפח גבוה יותר. כמה מגבלות של שנתות המוליקמ האוסף ועיבוד כוללים i) שיעור גבוה של הפרעות הומוציטים, ii) המוליקמ זיהום עם שיבושים באמצע המעיים, ו iii) נמוך המוליקמ האחסון התאוששות. כאשר המוליקמ נאסף באמצעות חיתוך הרגל, המוליש לוקח זמן לצבור בפתיחת הרגל, העדפה תהליך קרישת דם. בנוסף, פחות הומוציטים מתקבלים באוסף דרך הרגל בהשוואה לאוסף הקודם, למרות שהשיטה הראשונה נחשבת קלה יותר לביצוע. הבנת התגובה החיסונית של קרציות בתיווך על ידי סוכני entomopathogenic מסייעת לחשוף פתוגנזה שלהם ולפתח מטרות חדשות עבור שליטה קרציות. תהליכי החיסונים המתוארים כאן דורשים משאבים טכנולוגיים נמוכים מאוד וניתן להשתמש בהם לא רק כדי לחשוף קרציות לאורגניזמים פתוגניים. באופן דומה, את האוסף של שנתות המוליקמ הוא עשוי לייצג את הצעד הראשון עבור מחקרים פיזיולוגיים רבים.
Introduction
שנתות הבקר, ריפיקאראוס מיקרופלוס, הוא hematophagus ectoparasite עם השפעה שלילית עצומה על בעלי חיים באזורים טרופיים. שנתות זה הוא וקטור של סוכני פתוגניים כגון babesia סטרפטקוקוס, babesia bigemina, ו אנקלמה מרגיא כי, בשילוב עם הנזק העוצר הישיר, יכול להפחית את ייצור החלב והבשר, לגרום לאנמיה ובסופו של דבר מוות. הפסדים שנגרמו על ידי הפקעון זה הוערך ב3,240,000,000 דולר בשנה בברזיל1. שיטות בר-קיימא הינן מבוקשת והשימוש בסוכני entomopathogenic נחשב חלופה מבטיחה להפחתת השימוש בחומרי הדברה כימיים2,3,4.
פטריות Entomopathogenic, כגון Metarhizium spp., הם אויבים טבעיים של פרוקי רגליים כולל קרציות, וכמה מבודד ניתן להשתמש כמו biocontrollers קרים. פתוגנים אלה באופן פעיל להדביק את המארח דרך קוטיקולה וליישב את גופם2,5,6. ככל שהזיהום מתפתח, תגובות סלולריות ומוסריות מתווכת על ידי המערכת החיסונית שנתות. ניתוח של שנתות המוליקמ הוא דיווח ככלי שימושי כדי להעריך את התגובות החיסונית לאחר מאתגרת עם פתוגנים7,8.
התגובה החיסונית של פרוקי רגליים מחולקת תגובות ומוראלית ו הסלולר. התגובה ההואתית כוללת תהליכים hemagglutination ייצור של חלבונים מיקרוביאלית/פפטידים, בעוד התגובה החיסונית הסלולר מבוצעת דרך הומוציטים. תאים אלה נמצאים המוליקמ מכל פרוקי רגליים והם דיווחו לפתח תפקיד הבעה במחקרים הכרוכים בתגובה החיסונית מולדת9, כפי שהוא קשור ישירות הפאגוציטוזה ותהליכים אנקפסולציה. לפיכך, מחקרים על הומוציטים יכולים לעזור לחקור את נתיב המוות ולהבין תהליכים כגון אוטומטי, אפופטוזיס, ו נמק. ביצורים מסוימים כמו bivalves, אוסף הומוציטים הפנים מגבלות כמו הפרעה לתא, נמוך נפח המוליש השיגה, וריכוז נמוך של תאים התאושש10. לעתים קרובות מאוד, בהתאם למתודולוגיה המוחלת, ריכוז מופחת של תאים מתקבל, להשפיע ישירות על התאים הקוונפיקציה וניתוח.
מספר הומוציטים במחזור המוליקמ הוא משתנה בין פרוקי רגליים שונים, זה יכול לשנות באותו מינים בשל שלבים פיסיולוגיים שונים כגון סקס, גיל, ואת השלב ההתפתחותי של פרוקי הרגליים11. הומוציטים ניתן גם למצוא דבק לאיברים מסוימים ולהיות שוחרר לתוך זרימת הדם רק לאחר תהליך הזיהום11. עם זאת, רוב המחקרים דיווחו על השימוש בחרקים, בעוד שקרציות נשארות פחות בחקר הפיזיולוגיה והפתולוגיה שלהם. למרות הפתוגן ואוסף המוליקמ בקרציות הם פחות טכניקות בשימוש, הקמת שיטות סטנדרטיות מסייעת לפיתוח מחקרים מדויקים יותר.
מטרת המחקר הנוכחי היתה להשוות את השיטות הנפוצות ביותר עבור המוליקמ אוסף וחיסונים של פתוגנים לתוך R. microplus קרציות, הערכת היעילות של רכישת המוליקמ רכש וריכוז הומוציטים.
Protocol
Representative Results
Discussion
החיסונים של פתוגנים הוא שימושי כאשר המחקר שואפת לחקור את הפעולה vivo של מיקרואורגניזמים במודלים פרוקי-רגליים ניסיוני כי זה מבטיח כי הפתוגן הוא בתוך המארח. ניתן להחיל את הטכניקה גם על מולקולות של החיסונים כגון RNA הפרעה (RNAi). החיסון בין הסטום לקפיאולום נחשב לקל יותר לביצוע, אך לעתים קרובות הוא ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה היה ממומן בחלקו על ידי המלון העליון (שכמיות) מברזיל, קוד כספים מספר 001. גלימות סיפקה מלגת דוקטורט עבור A.F. מרציאנו. אנו מודים למועצה הלאומית לפיתוח מדעי וטכנולוגי (CNPq) של ברזיל למתן מלגת דוקטורט לג פיורארוטי. מחקר זה היה נתמך גם על ידי מענקים של קרלוס חגיאס קרן Filho לחקר מדינת ריו דה ז’ניירו (FAPERJ) ו CNPq. V.R.E.P. Bittencourt הוא חוקר CNPq.
Materials
| Alkaline Hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | A1727 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| EDTA | Synth | 2706 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000036 | |
| Flexible rubber | BD | ||
| Giemsa stain | Sigma-Aldrich | 48900-500ML-F | |
| Glass capillary | CTechGlass | CT95-02 | |
| Insulin syringe (needle) | BD | SKU: 324910 | |
| KH2PO4 | Vetec | 60REAVET014512 | |
| Leibovitz's L-15 culture medium | Gibco | 11415-064 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| Microscope slides | Kasvi | K5-7105 | |
| Microtubes | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Na2HPO4 | Vetec | 60REAVET014593 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0111 | |
| Penicillin | Gibco | 15140163 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 |
References
- Grisi, L., et al. Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).
- Schrank, A., Vainstein, M. H. Metarhizium anisopliae enzymes and toxins. Toxicon. 56 (7), 1267-1274 (2010).
- Camargo, M. G., et al. Metarhizium anisopliae for controlling Rhipicephalus microplus ticks under field conditions. Veterinary Parasitology. 223, 38-42 (2016).
- Perinotto, W. M. S., et al. In vitro pathogenicity of different Metarhizium anisopliae s.l. isolates in oil formulations against Rhipicephalus microplus. Biocontrol Science and Technology. 27 (3), 338-347 (2017).
- Pedrini, N., Crespo, R., Juarez, M. P. Biochemistry of insect epicuticle degradation by entomopathogenic fungi. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology and Pharmacolpgy. 146 (1-2), 124-137 (2007).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the surface: Entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4 (3), 357-374 (2013).
- Angelo, I. C., et al. Detection of serpins involved in cellular immune response of Rhipicephalus microplus challenged with fungi. Biocontrol Science and Technology. 24 (3), 351-360 (2014).
- De Paulo, J. F., et al. Rhipicephalus microplus infected by Metarhizium: unveiling hemocyte quantification, GFP-fungi virulence, and ovary infection. Parasitology Research. 117, 1847-1856 (2018).
- Marmaras, V. J., Lampropoulou, M. Regulators and signalling in insect haemocyte immunity. Cell Signal. 21, 186-195 (2009).
- Hinzmann, M. F., Lopes-Lima, M., Gonçalves, J., Machado, J. Antiaggregant and toxic properties of different solutions on hemocytes of three freshwater bivalves. Toxicological & Environmental Chemistry. 95, 790-805 (2013).
- Nation, J. L. . Insect Physiology and Biochemistry. , (2016).
- Gene, J. Mémoires de l’Académie royale des sciences. Torino. 9, 751 (1848).
- Lees, A. D., Beament, J. W. L. An organ waxing in ticks. The Quarterly Journal of the Mythic Society. 7, 291-332 (1948).
- Sonenshine, D. E., Roe, R. M. . Biology of ticks. , (2014).
- Tan, J., et al. Characterization of hemocytes proliferation in larval silkworm Bombyx mori. Journal of Insect Physiology. 59 (6), 595-603 (2013).
- Bowden, T. J. The humoral immune systems of the American lobster (Homarus americanus) and the European lobster (Homarus gammarus). Fish Research. 186, 367-371 (2017).
- Sonenshine, D. E., Hynes, W. L. Molecular characterization and related aspects of the innate immune response in ticks. Frontiers in Bioscience. 13, 7046-7063 (2008).
- Tsakas, S., Marmaras, V. Insect immunity and its signaling: an overview. Invertebrate Survival Journal. 7, 228-238 (2010).
- Burgdorfer, W. Hemolymph Test. A technique for detection of Rickettsiae in ticks. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 19, 1010-1014 (1970).
- Dunham-Ems, S. M., et al. Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks. Journal of Clinical Investigation. 119, 3652-3665 (2009).
- Patton, T. G., et al. Saliva, salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. 60, e3894 (2012).
