無脊椎動物の病理学研究に向けた Hemolymph のMetarhizium Blastospores の収集とRhipicephalus Microplusダニへの接種の開示
Summary
ダニ hemolymph の分析は、いくつかの病原体が病気を引き起こす方法と、ダニ免疫学的がこの感染症にどのように反応するかに関する重要な情報源を表しています。本研究は、真菌 propagules を接種し、 Rhipicephalus microplusうっ積の雌から hemolymph を採取する方法を示す。
Abstract
ダニは、吸血シソとRhipicephalus microplusは、貧血、体重減少、動物の革の減価償却を引き起こし、またいくつかの病原体のベクターとして作用することができるので、獣医学の非常に重要な義務があります。これらの寄生虫を防除するための法外な費用のために、化学殺ダニ剤の不適切な使用によって引き起こされる環境への損傷、および伝統的な parasiticides に対する抵抗の増加、ダニの代替制御、の使用によるentomopathogenic 菌類は、例えば、興味深いアプローチと考えられてきました。それにもかかわらず, ダニの免疫システムは、これらの entomopathogens と戦うために動作する方法を示しているいくつかの研究.従って、この議定書はうっ積の女性への entomopathogen 接種のために使用される2つの方法および hemolymph のコレクションおよび hemocytes 収穫のために使用される2つの技術を示す。ダニの女性の体の脚の挿入で病原体の接種は、頻繁に Gené’s 器官を損傷する恒星と capitulum の間の接種とは異なり、女性の生物学的パラメータの評価を可能にする。背 hemolymph のコレクションは、脚を介したコレクションよりも高いボリュームの回復をもたらした。ダニ hemolymph の収集と処理のいくつかの制限は、i) hemocytes 「破壊」の高いレート、ii) hemolymph 破壊 midgut、および iii) 低 hemolymph ボリュームの回復が含まれます。Hemolymph が足の切断を通して集められるとき、hemolymph は凝固プロセスを支持する足の入り口で集まるために時間を取る。さらに、最初の方法は実行が容易であると考えられるにもかかわらず、背のコレクションと比較して、脚を通してコレクションで得られる hemocytes は少なくなります。Entomopathogenic 剤によって媒介されるマダニにおける免疫応答を理解することは、その病因を明らかにし、ティック制御のための新しい標的を開発するのに役立つ。ここに記載されている接種プロセスは、非常に低い技術資源を必要とし、病原性微生物にダニを暴露するだけでなく使用することができる。同様に、ダニ hemolymph の収集は、多くの生理学的研究のための最初のステップを表すことができる。
Introduction
牛のダニ、 Rhipicephalus microplusは、熱帯地域の家畜に巨大な負の影響を与える hematophagus ectoparasite です。このダニは、バベシアボビス、バベシア Bigemina、およびAnaplasma marginaleなどの病原性薬剤のベクターであり、直接 hemofeeding 損傷と組み合わせることにより、乳および食肉生産量を減少させることができ、貧血および究極的には死を引き起こす。この ectoparasite による損失は、ブラジル1年間で32億4000万ドルと見積もられた。持続可能な方法が求められており、entomopathogenic 剤の使用は、化学殺ダニ薬2,3,4の使用を減らすための有望な代替と考えられています。
Metarhizium属などの Entomopathogenic 菌類は、ダニを含む節足動物の天敵であり、biocontrollers として使用することができます。これらの病原体は、表皮を通して宿主に積極的に感染し、彼らの体2、5、6を植民地化する。感染が進行するにつれて、細胞および体液性応答はダニ免疫系によって媒介される。ダニ hemolymph の分析は、病原体7,8に挑戦した後の免疫応答を評価するのに有用なツールとして報告されている。
節足動物の免疫応答は、体液性応答および細胞反応に分けられる。体液性応答には、赤血球凝集反応プロセスおよび抗菌タンパク質/ペプチドの産生が含まれ、一方、細胞性免疫応答は hemocytes を介して行われる。これらの細胞は、すべての節足動物から hemolymph に存在し、それが直接貪食とカプセル化プロセスに関連しているように、先天性免疫応答9を含む研究で表現力豊かな役割を開発するために報告されています。したがって、hemocytes に関する研究は、死の経路を調査し、オートファジー、アポトーシス、壊死などのプロセスを理解するのに役立ちます。一部の無脊椎動物は二枚貝類として、hemocytes のコレクションは、細胞破壊、低 hemolymph 量、および低濃度の回収細胞10のような制限に直面する。非常に頻繁に、適用される方法論に応じて、細胞の減少した濃度が得られ、細胞の定量化および分析に直接影響を与える。
Hemolymph で循環する hemocytes の数は、異なる節足動物の間で変動し、性別、年齢、および節足動物の発達段階11などの異なる生理的段階により同じ種で変化することができる。Hemocytes はまた、いくつかの臓器に付着し、感染プロセス11の直後に循環に放出されることが見出され得る。それにもかかわらず、ほとんどの研究では昆虫の使用が報告され、ダニは生理学や病理に関する調査が少ない。ダニの病原の接種および hemolymph のコレクションはより少なく使用された技術であるにもかかわらず、標準的な方法を確立することはより正確な研究の開発を助ける。
本研究の目的は、hemolymph の収集と病原体の接種のための最も使用された方法をmicroplusティックに比較し、hemolymph 獲得および hemocytes 濃度における有効性を評価することであった。
Protocol
Representative Results
Discussion
病原体が宿主の内部にあることを保証するので、研究が実験節足動物モデルにおける微生物の生体内作用を調査することを目的とする場合に、病原菌の接種が有用である。この技術はまた、RNA 干渉 (RNAi) などの接種分子にも適用することができる。恒星と capitulum の間の接種は、実行が容易であると考えられるが、しばしば臓器 Gené’s 損傷を与えるが、卵の生存率12,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ブラジル、金融コード001から Coordenacão ・デ・ Aperfeiçoamento ・デ・ Pessoal ・デ・ Nível ・スーペリア (ケープ) によって部分的に資金を調達しました。ケープは A.F. マルシアノ愛用のための博士奨学金を提供しました。我々は、j. Fiorotti のための博士課程奨学金を提供するブラジルの科学技術開発協議会 (CNPq) に感謝した。この研究は、カルロス・シャーガスフィーリョ国際財団のリオデジャネイロ州 (FAPERJ) および CNPq V.R.E.P. の研究助成金によっても支援されました。ビッテンコートは CNPq の研究者です。
Materials
| Alkaline Hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | A1727 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| EDTA | Synth | 2706 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000036 | |
| Flexible rubber | BD | ||
| Giemsa stain | Sigma-Aldrich | 48900-500ML-F | |
| Glass capillary | CTechGlass | CT95-02 | |
| Insulin syringe (needle) | BD | SKU: 324910 | |
| KH2PO4 | Vetec | 60REAVET014512 | |
| Leibovitz's L-15 culture medium | Gibco | 11415-064 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| Microscope slides | Kasvi | K5-7105 | |
| Microtubes | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Na2HPO4 | Vetec | 60REAVET014593 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0111 | |
| Penicillin | Gibco | 15140163 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 |
References
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