Divulgation de la collection d’hémolymphe et inoculation des blastospores de Métarhizium dans les tiques de Rhipicephalus MICROPLUS vers les études de pathologie des invertébrés
Summary
L’analyse de l’hémolymphe des tiques représente une source importante d’information sur la façon dont certains agents pathogènes causent la maladie et comment les tiques réagissent immunologiquement à cette infection. La présente étude montre comment inoculer les propagules fongiques et recueillir l’hémolymphe des femelles de Rhipicephalus MICROPLUS engorgés.
Abstract
Les tiques sont obligatoires ectoparasites hematophages et Rhipicephalus MICROPLUS a une grande importance en médecine vétérinaire parce qu’il provoque l’anémie, perte de poids, l’amortissement du cuir des animaux et peut également agir comme un vecteur de plusieurs agents pathogènes. En raison des coûts exorbitants pour contrôler ces parasites, les dommages à l’environnement causés par l’utilisation inappropriée d’acaricides chimiques, et la résistance accrue contre les parasiticides traditionnels, le contrôle alternatif des tiques, par l’utilisation de les champignons entomopathogènes, par exemple, ont été considérés comme une approche intéressante. Néanmoins, peu d’études ont démontré comment le système immunitaire de la tique agit pour combattre ces entomopathogènes. Par conséquent, ce protocole démontre deux méthodes utilisées pour l’inoculation ENTOMOPATHOGÈNE dans les femelles engorgées et deux techniques utilisées pour la collecte de l’hémolymphe et la récolte des hémocytes. L’inoculation de pathogènes à l’insertion de la jambe dans le corps de la femelle de tique permet l’évaluation des paramètres biologiques femelles contrairement à l’inoculation entre le Scutum et le capitulum, qui endommage fréquemment l’orgue de Gené. La collecte de l’hémolymphe dorsale a donné une récupération plus importante que la collecte par les jambes. Certaines limitations de la collecte et de la transformation de l’hémolymphe des tiques comprennent i) des taux élevés de perturbation des hémocytes, II) une contamination par l’hémolymphe avec un intestin moyen perturbé et III) une faible récupération du volume de l’hémolymphe. Lorsque l’hémolymphe est recueilli par la coupe des jambes, l’hémolymphe prend du temps pour s’accumuler à l’ouverture de la jambe, favorisant le processus de coagulation. En outre, moins d’hémocytes sont obtenus dans la collection par la jambe par rapport à la collection dorsale, même si la première méthode est considérée plus facile à effectuer. La compréhension de la réponse immunitaire dans les tiques médiées par des agents entomopathogènes aide à dévoiler leur pathogenèse et à développer de nouvelles cibles pour le contrôle des tiques. Les processus d’inoculation décrits ici exigent des ressources technologiques très faibles et peuvent être utilisés non seulement pour exposer les tiques à des microorganismes pathogènes. De même, la collecte de l’hémolymphe des tiques peut représenter la première étape pour de nombreuses études physiologiques.
Introduction
La tique du bétail, Rhipicephalus MICROPLUS, est un hématophage ectoparasite avec un énorme impact négatif sur le bétail dans les zones tropicales. Cette tique est le vecteur d’agents pathogènes tels que Babesia bovis, Babesia bigemina, et Anaplasma marginale qui, combinée avec les dommages hémoalimentaires directs, peut réduire le lait et la production de viande, provoquer l’anémie et, finalement, la mort. Les pertes causées par cette ectoparasite ont été estimées en 3,24 milliards dollars annuellement au Brésil1. Des méthodes durables sont exigées et l’utilisation d’agents entomopathogènes est considérée comme une alternative prometteuse pour réduire l’utilisation des acaricides chimiques2,3,4.
Les champignons entomopathogènes, tels que les Métarhizium spp., sont des ennemis naturels des arthropodes, y compris les tiques, et certains isolats peuvent être utilisés comme biocontrôleurs. Ces agents pathogènes infectent activement l’hôte par la cuticule et colonisent leur corps2,5,6. Au fur et à mesure que l’infection se développe, les réponses cellulaires et humorales sont médiées par le système immunitaire des tiques. L’analyse de l’hémolymphe des tiques est signalée comme un outil utile pour évaluer les réponses immunitaires après les défis avec les pathogènes7,8.
La réponse immunitaire des arthropodes est divisée en réponses humorales et cellulaires. La réponse humorale implique des processus d’hémagglutination et la production de protéines/peptides antimicrobiens, tandis que la réponse immunitaire cellulaire est effectuée à travers les hémocytes. Ces cellules sont présentes dans l’hémolymphe de tous les arthropodes et sont rapportées pour développer un rôle expressif dans les études impliquant la réponse immunitaire innée9, car elle est directement liée aux processus de phagocytose et d’encapsulation. En conséquence, les études sur les hémocytes peuvent aider à enquêter sur la voie de la mort et comprendre les processus tels que l’autophagie, l’apoptose, et la nécrose. Chez certains invertébrés comme les bivalves, la collection des hémocytes fait face à des limitations comme la perturbation cellulaire, le faible volume d’hémolymphe obtenu et la faible concentration des cellules récupérées10. Très fréquemment, selon la méthodologie appliquée, une concentration réduite des cellules est obtenue, affectant directement la quantification et l’analyse des cellules.
Le nombre d’hémocytes circulant dans l’hémolymphe est variable parmi les différents arthropodes et il peut changer dans la même espèce en raison de différents stades physiologiques tels que le sexe, l’âge et l’étape de développement de l’arthropode11. Les hémocytes peuvent également être trouvés collés à certains organes et être libérés en circulation juste après le processus d’infection11. Néanmoins, la plupart des études ont rapporté utiliser des insectes, tandis que les tiques restent moins explorées en ce qui concerne leur physiologie et pathologie. Malgré l’inoculation des pathogènes et la collecte de l’hémolymphe dans les tiques sont des techniques moins utilisées, l’établissement de méthodes standard aide à développer des études plus précises.
Le but de la présente étude était de comparer les méthodes les plus utilisées pour la collecte de l’hémolymphe et l’inoculation des agents pathogènes dans les tiques de R. MICROPLUS , en évaluant l’efficacité dans l’acquisition de l’hémolymphe et la concentration des hémocytes.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’inoculation d’agents pathogènes est utile lorsque l’étude vise à étudier l’action in vivo des microorganismes dans les modèles expérimentaux d’arthropodes, car elle assure que l’agent pathogène est à l’intérieur de l’hôte. La technique peut également être appliquée pour inoculer des molécules telles que l’interférence d’ARN (RNAi). L’inoculation entre le Scutum et le capitulum est considérée comme plus facile à effectuer mais endommage fréquemment l’orgue de Gené, ce qui comp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée en partie par le Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de nível Superior (CAPES) du Brésil, code des Finances 001. CAPES a fourni une bourse de doctorat pour M.A. Marciano. Nous remercions le Conseil national pour le développement scientifique et technologique (CNPq) du Brésil d’avoir fourni une bourse de doctorat pour J. Fiorotti. Cette recherche a également été soutenue par des subventions de la Fondation Carlos Chagas Filho pour la recherche de l’état de Rio de Janeiro (FAPERJ) et de CNPq. V.R.E.P. Bittencourt est un chercheur CNPq.
Materials
| Alkaline Hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | A1727 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| EDTA | Synth | 2706 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000036 | |
| Flexible rubber | BD | ||
| Giemsa stain | Sigma-Aldrich | 48900-500ML-F | |
| Glass capillary | CTechGlass | CT95-02 | |
| Insulin syringe (needle) | BD | SKU: 324910 | |
| KH2PO4 | Vetec | 60REAVET014512 | |
| Leibovitz's L-15 culture medium | Gibco | 11415-064 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| Microscope slides | Kasvi | K5-7105 | |
| Microtubes | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Na2HPO4 | Vetec | 60REAVET014593 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0111 | |
| Penicillin | Gibco | 15140163 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 |
References
- Grisi, L., et al. Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).
- Schrank, A., Vainstein, M. H. Metarhizium anisopliae enzymes and toxins. Toxicon. 56 (7), 1267-1274 (2010).
- Camargo, M. G., et al. Metarhizium anisopliae for controlling Rhipicephalus microplus ticks under field conditions. Veterinary Parasitology. 223, 38-42 (2016).
- Perinotto, W. M. S., et al. In vitro pathogenicity of different Metarhizium anisopliae s.l. isolates in oil formulations against Rhipicephalus microplus. Biocontrol Science and Technology. 27 (3), 338-347 (2017).
- Pedrini, N., Crespo, R., Juarez, M. P. Biochemistry of insect epicuticle degradation by entomopathogenic fungi. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology and Pharmacolpgy. 146 (1-2), 124-137 (2007).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the surface: Entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4 (3), 357-374 (2013).
- Angelo, I. C., et al. Detection of serpins involved in cellular immune response of Rhipicephalus microplus challenged with fungi. Biocontrol Science and Technology. 24 (3), 351-360 (2014).
- De Paulo, J. F., et al. Rhipicephalus microplus infected by Metarhizium: unveiling hemocyte quantification, GFP-fungi virulence, and ovary infection. Parasitology Research. 117, 1847-1856 (2018).
- Marmaras, V. J., Lampropoulou, M. Regulators and signalling in insect haemocyte immunity. Cell Signal. 21, 186-195 (2009).
- Hinzmann, M. F., Lopes-Lima, M., Gonçalves, J., Machado, J. Antiaggregant and toxic properties of different solutions on hemocytes of three freshwater bivalves. Toxicological & Environmental Chemistry. 95, 790-805 (2013).
- Nation, J. L. . Insect Physiology and Biochemistry. , (2016).
- Gene, J. Mémoires de l’Académie royale des sciences. Torino. 9, 751 (1848).
- Lees, A. D., Beament, J. W. L. An organ waxing in ticks. The Quarterly Journal of the Mythic Society. 7, 291-332 (1948).
- Sonenshine, D. E., Roe, R. M. . Biology of ticks. , (2014).
- Tan, J., et al. Characterization of hemocytes proliferation in larval silkworm Bombyx mori. Journal of Insect Physiology. 59 (6), 595-603 (2013).
- Bowden, T. J. The humoral immune systems of the American lobster (Homarus americanus) and the European lobster (Homarus gammarus). Fish Research. 186, 367-371 (2017).
- Sonenshine, D. E., Hynes, W. L. Molecular characterization and related aspects of the innate immune response in ticks. Frontiers in Bioscience. 13, 7046-7063 (2008).
- Tsakas, S., Marmaras, V. Insect immunity and its signaling: an overview. Invertebrate Survival Journal. 7, 228-238 (2010).
- Burgdorfer, W. Hemolymph Test. A technique for detection of Rickettsiae in ticks. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 19, 1010-1014 (1970).
- Dunham-Ems, S. M., et al. Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks. Journal of Clinical Investigation. 119, 3652-3665 (2009).
- Patton, T. G., et al. Saliva, salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. 60, e3894 (2012).
