Summary

تصنيع مستقبلات مستضد تشياريك (CAR) خلايا T للعلاج المناعي بالتبني

Published: December 17, 2019
doi:

Summary

نحن وصف نهج لتوليد موثوق مستقبلات مستضد الشمبانزي (CAR) T الخلايا واختبار تمايزها ووظيفتها في المختبر والجسم الخارجي.

Abstract

العلاج المناعي بالتبني يبشر بمعالجه السرطان والامراض المعدية. نحن وصف نهج بسيط لنقل الخلايا الاساسيه الإنسان T مع مستقبلات مستضد تشيريك (CAR) وتوسيع ذريه السابقين الجسم البشري. ونحن تشمل المقايسات لقياس التعبير سيارة ، فضلا عن التمايز ، والقدرة التكاثري والنشاط لحل. ونحن وصف الاختبارات لقياس إنتاج السايسيسين المستجيب وإفراز خلوية التهابيه في خلايا السيارات T. نهجنا يوفر طريقه موثوقه وشامله للثقافة الخلايا السيارات T للنماذج السريرية للعلاج المناعي بالتبني.

Introduction

مستقبلات مستضد تشيريك (السيارات) توفير نهج واعده لأعاده توجيه الخلايا T ضد مستضدات الأورام متميزة. السيارات هي المستقبلات الاصطناعية التي تربط هدف مستضد. وفي حين ان تكوينها الدقيق متغير ، فان السيارات تحتوي عموما علي 3 مجالات متميزة. المجال خارج الخلية يوجه ملزمه لمستضد الهدف ويتكون عاده من قطعه واحده الجسم المضاد سلسله مرتبطة بالسيارة عن طريق المفصلي خارج الخلية. المجال الثاني ، المستمدة عاده من سلسله CD3ζ من مستقبلات الخلية T (TCR) المعقدة ، ويعزز التنشيط الخلية T بعد مشاركه السيارة. يتم تضمين مجال كوستيمولاتوري الثالث لتعزيز وظيفة الخلية T, التجهيز, الأيض, والمثابرة. نجاح العلاج بالخلايا T السيارة في مختلف الأورام الخبيثة التي تكون الدم بما في ذلك خلايا الدم الليمفاوية الحاده (ALL) ، سرطان الدم اللمفاوي المزمن (cll) والورم النخاعي المتعدد يسلط الضوء علي وعد العلاجية لهذا النهج1،2،3،4،5،6. الاخيره أداره الاغذيه والعقاقير (FDA) الموافقات لاثنين من العلاجات الخلوية CD19 الخاصة بالسيارة t, تيساجنليكلوسيل للأطفال والشباب البالغين ALL و axicabtagene ciloleucel لانتشار الأورام اللمفاوية ب الخلية الكبيرة, يعزز الجدارة الانتقالية من العلاج بالخلايا

وتشمل النهج المستندة إلى T السيارات عزل الخلايا T من الدم المحيطي ، والتنشيط ، والتعديل الجيني ، والتوسع الجسم السابق. التمايز هو معلمه هامه تنظم فعاليه الخلية تي السيارة. وفقا لذلك ، وتقييد التمايز الخلية T خلال الثقافة السابقة فيفو يعزز قدره المنتج غرست لكسب الطعم ، وتوسيع ، وتستمر ، وتوفير المناعة علي المدى الطويل بعد نقل التبني2،7،8،9. تتكون الخلايا t من عده مجموعات فرعيه متميزة بما في ذلك: الخلايا الساذجة T (Tn) ، والذاكرة المركزية (الطب الأساسي) ، والذاكرة المستجيب (تيم) ، والمنحرف متمايزة (Tte) وذاكره الخلايا الجذعية (Tscm). المستجيب المتمايزة الخلايا T لديها قدره لحل قويه. ومع ذلك ، فهي قصيرة الأمد والطعم سيئه10،11،12. وعلي النقيض من ذلك ، t الخلايا مع النمط الظاهري اقل تمايزا بما في ذلك الخلايا الساذجة t والطب العام معرض متفوقة التجهيز والقدرات التكاثري بعد نقل الخلية بالتبني13،14،15،16،17،18. تكوين الخلايا T التي تم جمعها في المنتجات المصنعة مسبقا يمكن ان تختلف عبر المرضي ويرتبط مع الإمكانات العلاجية للخلايا السيارات T. ترتبط نسبه الخلايا التائية ذات الτ الشبيهة بالسذاجة في منتج البدايات الاوليه بالاستجابة السريرية والعلاجية19.

مده الثقافة هي معلمه هامه تؤثر علي التمايز في خلايا السيارات T المعدة لنقل التبني. وضعنا مؤخرا نهجا لتوليد اعلي جوده الخلايا السيارات T باستخدام نموذج الثقافة مختصر20. وباستخدام نهجنا ، أظهرنا ان الثقافة المحدودة تؤدي إلى ظهور خلايا السيارات T مع وظيفة المستجيب المتفوقة والمثابرة بعد نقل التبني في نماذج الكسب غير المزروع من ابيضاض الدم. هنا ، نقدم النهج لتوليد موثوق بها خلايا CART19 (الخلايا الذاتية T هندستها للتعبير عن المضادة لCD19 scFv تعلق علي CD3ζ والمجالات الإشارات 4-1BB) وتشمل وصفا مفصلا لمقايسات التي توفر نظره ثاقبه في النشاط الحيوي للسيارة وفعالية قبل نقل التبني.

Protocol

تمت الموافقة علي جميع الدراسات الحيوانية من قبل لجنه الرعاية الحيوانية المؤسسية والاستخدام من جامعه بنسلفانيا. 1. T تنشيط الخلية ، والتوصيل ، والتوسع تنشيط الخلايا الاساسيه البشرية الاوليه الطازجة أو بالتبريد عن طريق خلط مع الخرز المغناطيسي المضادة CD3/CD28 (علي سبيل الم?…

Representative Results

باستخدام الطرق الموصوفة أعلاه ، قمنا بتحفيز وتوسيع خلايا T لمده 3 أو 9 أيام (الشكل 1ا ، ب). وحللنا أيضا ملامح التمايز الخاصة بهم ، علي النحو المبين في استراتيجية النابض المبينة في الشكل 1جيم، عن طريق قياس وفره البروتينات السكرية المميزة التي …

Discussion

هنا ونحن وصف النهج لقياس وظيفة وفعالية الخلايا السيارات T تحصد علي فترات متفاوتة في جميع انحاء الثقافة المجرية السابقة. توفر أساليبنا رؤية شامله في الاختبارات المصممة لتقييم القدرة التكاثرية وكذلك وظيفة المستجيب في المختبر. ونحن وصف كيفيه قياس النشاط الخلية T السيارات بعد التحفيز من خلال…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال التمويل الذي قدمته شركه نوفارتس للادويه من خلال تحالف بحثي مع جامعه بنسلفانيا (مايكل c. Milone) ، فضلا عن جائزه العالم لمؤسسه سانت بالدريك (سابا غاسيمي).

Materials

Anti CD3/CD28 dynabeads Thermo Fisher 40203D
APC Mouse Anti-Human CD8 BD Biosciences 555369 RRID:AB_398595
APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody BD Biosciences 560179 RRID:AB_1645481
BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate BD Biosciences 349202
BD Trucount Absolute Counting Tubes BD Biosciences 340334
Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody BioLegend 317444 RRID:AB_2561866
Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody BioLegend 317322 RRID:AB_2561911
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit Life Technolohgies C34554
CountBright Absolute Counting Beads, Invitrogen C36950
FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody BD Pharmingen 561271 RRID:AB_10561679
FITC Mouse Anti-Human CD4 BD Biosciences 555346 RRID:AB_395751
HEPES Gibco 15630-080
Human AB serum Valley Biomedical HP1022
Human IL-2 IS, premium grade Miltenyi 130-097-744
L-glutamine Gibco 28030-081
Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux Perkin Elmer
LIVE/DEAD Fixable Violet Molecular Probes L34964
Multisizer Coulter Counter Beckman Coulter
Na251CrO4 Perkin Elmer NEZ030S001MC
Pacific Blue anti-human CD14 Antibody BioLegend 325616 RRID:AB_830689
Pacific Blue anti-human CD19 Antibody BioLegend 302223
PE anti-human CD45RO Antibody BD Biosciences 555493 RRID:AB_395884
PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody BioLegend 305610 RRID:AB_493652
PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody Beckman Coulter A54823
Phenol red-free medium Gibco 10373-017
UltraPure SDS Solution, 10% Invitrogen 15553027
Via-Probe BD Biosciences 555815
X-VIVO 15 Gibco 04-418Q
XenoLight D-Luciferin – K+ Salt Perkin Elmer 122799

References

  1. Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).
  2. Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
  3. Kalos, M., et al. T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia. Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73 (2011).
  4. Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).
  5. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  6. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
  7. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139 (2015).
  8. Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).
  9. Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
  10. Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease. Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).
  11. Brestrich, G., et al. Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy. American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).
  12. Savoldo, B., et al. Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs). Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).
  13. Berger, C., et al. Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates. The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).
  14. Gattinoni, L., et al. A human memory T cell subset with stem cell-like properties. Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).
  15. Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).
  16. Klebanoff, C. A., et al. Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).
  17. Wang, X., et al. Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice. Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).
  18. Wang, X., et al. Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer. Oncoimmunology. 5 (1), e1072671 (2016).
  19. Fraietta, J., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).
  20. Ghassemi, S., et al. Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells. Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).
  21. Milone, M. C., et al. Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).
  22. Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
  23. Cui, G., et al. IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity. Cell. 161 (4), 750-761 (2015).
  24. Xu, Y., et al. Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15. Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).
  25. Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies. Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323 (2016).

Play Video

Cite This Article
Ghassemi, S., Milone, M. C. Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy. J. Vis. Exp. (154), e59949, doi:10.3791/59949 (2019).

View Video