我们描述了一种可靠地生成嵌合抗原受体(CAR)T细胞的方法,并测试其体外和体内的分化和功能。
采用免疫疗法对治疗癌症和传染病有希望。我们描述了一种用嵌合抗原受体(CAR)转导原发人类T细胞并扩展其后代前体的简单方法。我们包括检测,以测量CAR表达以及分化,增殖能力和细胞解细胞活性。我们描述检测,以测量在CAR T细胞中产生效应细胞因子和炎症细胞因子分泌物。该方法为采用免疫治疗的临床前模型培养CAR T细胞提供了可靠、全面的方法。
奇美抗原受体(CARs)提供了一种有希望的方法,可以针对不同的肿瘤抗原重定向T细胞。CARs 是结合抗原靶点的合成受体。虽然其精确组成是可变的,但 CA 通常包含 3 个不同的域。细胞外域直接结合到靶抗原,通常由通过细胞外铰链与CAR相连的单链抗体片段组成。第二个域,通常来自T细胞受体(TCR)复合物的CD3*链,促进CAR参与后的T细胞激活。包括第三个成本领域,以增强T细胞功能,移植,代谢和持久性。CAR T细胞治疗在各种造血恶性肿瘤中的成功,包括B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和多发性骨髓瘤,凸显了这种方法1、2、3、4、5、6的治疗前景。最近美国食品和药物管理局 (FDA) 批准两种 CD19 特异性 CAR T 细胞疗法,针对儿科和年轻成人的 tisagenlecleucel 和用于扩散大 B 细胞淋巴瘤的 axicabagene 胆珠,强化了 CAR T 细胞治疗的转化价值。
基于CAR T的方法包括从外周血分离T细胞、活化、基因改造和外体扩张。分化是调节CAR T细胞疗效的重要参数。因此,在外体培养过程中限制T细胞分化可增强注入产物的移植、扩张和坚持能力,在采用转移2、7、8、9之后提供长期免疫监测。T细胞由几个不同的子集组成,包括:幼稚的T细胞(Tn)、中央记忆(Tcm)、效应器记忆(Tem)、效应器分化(T)和干细胞记忆(Tscm)。效应者分化T细胞具有强效细胞解细胞能力;然而,他们是短暂的和移植差10,11,12。相反,具有较少分化表型的T细胞,包括幼稚的T细胞和Tcm在采用细胞转移13、14、15、16、17、18之后表现出优异的增生和增殖能力。预制造产品中收集的T细胞的组成可能因患者而异,并与CAR T细胞的治疗潜力相关。在起始阿普西斯产品中,具有天真型免疫表型的T细胞比例与移植和临床反应高度相关19。
培养持续时间是影响CAR T细胞分化的重要参数,为采用转移做准备。我们最近开发了一种方法,使用缩写培养范式20生成高质量的CAR T细胞。利用我们的方法,我们表明,有限的培养导致CAR T细胞具有优越的效应功能和持久性后,在白血病的异种移植模型的收养转移。在这里,我们介绍可靠生成CART19细胞的方法(用于表达CD33和4-1BB信令域的抗CD19 scFv的自体T细胞),并包括分析的详细说明,在采用转移之前提供对CAR T生物活性和有效性的洞察。
在这里,我们描述了测量CAR T细胞的功能和功效的方法,这些细胞在整个外体培养过程中以不同的间隔收获。我们的方法提供全面的检测分析,旨在评估增殖能力以及体外效应器功能。我们描述了如何通过CAR刺激测量CAR T细胞活性,并使用在对数扩张阶段的第3天和第9天收获的CAR T细胞进行详细白血病异种移植模型。
在比较在外体扩张期间在不同时间点采集的CAR T细胞的功效存?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作部分得到了诺华制药公司通过与宾夕法尼亚大学(迈克尔·米隆)的研究联盟以及圣巴尔德里克基金会学者奖(萨巴·加塞米)提供的资金的支持。
Anti CD3/CD28 dynabeads | Thermo Fisher | 40203D | |
APC Mouse Anti-Human CD8 | BD Biosciences | 555369 | RRID:AB_398595 |
APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody | BD Biosciences | 560179 | RRID:AB_1645481 |
BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | |
BD Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 317444 | RRID:AB_2561866 |
Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | BioLegend | 317322 | RRID:AB_2561911 |
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Life Technolohgies | C34554 | |
CountBright Absolute Counting Beads, | Invitrogen | C36950 | |
FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody | BD Pharmingen | 561271 | RRID:AB_10561679 |
FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD Biosciences | 555346 | RRID:AB_395751 |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
Human IL-2 IS, premium grade | Miltenyi | 130-097-744 | |
L-glutamine | Gibco | 28030-081 | |
Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux | Perkin Elmer | ||
LIVE/DEAD Fixable Violet | Molecular Probes | L34964 | |
Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter | ||
Na251CrO4 | Perkin Elmer | NEZ030S001MC | |
Pacific Blue anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325616 | RRID:AB_830689 |
Pacific Blue anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302223 | |
PE anti-human CD45RO Antibody | BD Biosciences | 555493 | RRID:AB_395884 |
PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody | BioLegend | 305610 | RRID:AB_493652 |
PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody | Beckman Coulter | A54823 | |
Phenol red-free medium | Gibco | 10373-017 | |
UltraPure SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
Via-Probe | BD Biosciences | 555815 | |
X-VIVO 15 | Gibco | 04-418Q | |
XenoLight D-Luciferin – K+ Salt | Perkin Elmer | 122799 |