Herstellung von Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Zellen für die Adoptivimmuntherapie
Summary
Wir beschreiben einen Ansatz zur zuverlässigen Generierung von chimeric antigen receptor (CAR) T-Zellen und testen deren Differenzierung und Funktion in vitro und in vivo.
Abstract
Die Adoptivimmuntherapie verspricht die Behandlung von Krebs und Infektionskrankheiten. Wir beschreiben einen einfachen Ansatz, um primäre menschliche T-Zellen mit chimärem Antigenrezeptor (CAR) zu transduzieren und ihre Nachkommen ex vivo zu erweitern. Wir umfassen Assays zur Messung des CAR-Ausdrucks sowie Differenzierung, Proliferativfähigkeit und zytolytische Aktivität. Wir beschreiben Assays zur Messung der Cytokinproduktion und der entzündlichen Zytokinsekretion in CAR-T-Zellen. Unser Ansatz bietet eine zuverlässige und umfassende Methode zur Kultur von CAR-T-Zellen für präklinische Modelle der Adoptivimmuntherapie.
Introduction
Chimäre Antigenrezeptoren (CARs) bieten einen vielversprechenden Ansatz, um T-Zellen gegen verschiedene Tumorantigene umzuleiten. CARs sind synthetische Rezeptoren, die ein Antigenziel binden. Obwohl ihre genaue Zusammensetzung variabel ist, enthalten CARs im Allgemeinen 3 verschiedene Domänen. Die extrazelluläre Domäne leitet die Bindung an ein Zielantigen und besteht in der Regel aus einem einkettigen Antikörperfragment, das über ein extrazelluläres Scharnier mit dem CAR verknüpft ist. Die zweite Domäne, die üblicherweise von der CD3-Kette des T-Zell-Rezeptor-Komplexes (TCR) abgeleitet wird, fördert die T-Zellaktivierung nach CAR-Eingriff. Eine dritte Costimulatorische Domäne ist enthalten, um T-Zell-Funktion zu verbessern, Transplantation, Stoffwechsel, und Persistenz. Der Erfolg der CAR-T-Zelltherapie bei verschiedenen hämatopoetischen Malignomen, einschließlich akuter lymphatischer Leukämie (ALL), chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) und multiplem Myelom, unterstreicht das therapeutische Versprechen dieses Ansatzes1,2,3,4,5,6. Die jüngsten Zulassungen der Food and Drug Administration (FDA) für zwei CD19-spezifische CAR-T-Zelltherapien, Tisagenlecleucel für pädiatrische und junge Erwachsene ALL und Axicabtagene ciloleucel für diffuses großes B-Zell-Lymphom, verstärken den translationalen Wert der CAR T-Zelltherapie.
CAR T-basierte Ansätze beinhalten die Isolierung von T-Zellen aus peripherem Blut, Aktivierung, genetische Veränderung und Expansion ex vivo. Die Differenzierung ist ein wichtiger Parameter, der die Wirksamkeit von CAR-T-Zellen reguliert. Dementsprechend verbessert die Einschränkung der T-Zell-Differenzierung während der Ex-vivo-Kultur die Fähigkeit des infundierten Produkts, sich zu engrafieren, zu erweitern und fortzubestehen, was eine langfristige Immunüberwachung nach derAdoption2,7,8,9bietet. T-Zellen bestehen aus mehreren unterschiedlichen Teilmengen, darunter: naive T-Zellen (Tn), Zentralgedächtnis (Tcm), Effektorspeicher (Tem), Effektor differenziert (Tte) und Stammzellgedächtnis (Tscm). Effektor differenzierte T-Zellen haben starke zytolytische Fähigkeit; jedoch sind sie kurzlebig und veredeln schlecht10,11,12. Im Gegensatz dazu weisen T-Zellen mit einem weniger differenzierten Phänotyp, einschließlich naiver T-Zellen und Tcm, nach der Adoptivzellübertragung13,14,15,16,17,18eine überlegene Engraftmentierung und proliferative Fähigkeiten auf. Die Zusammensetzung der gesammelten T-Zellen im vorgefertigten Produkt kann von Patient zu Patient variieren und korreliert mit dem therapeutischen Potenzial von CAR-T-Zellen. Der Anteil der T-Zellen mit einem naiven Immunophenotyp im Ausgangsapherese-Produkt ist stark korreliert mit der Transplantation und dem klinischen Ansprechen19.
Die Kulturdauer ist ein wichtiger Parameter, der die Differenzierung in CAR-T-Zellen beeinflusst, die für die Adoptivübertragung vorbereitet sind. Wir haben vor kurzem einen Ansatz entwickelt, um CAR-T-Zellen von höchster Qualität mit einem abgekürzten Kulturparadigma20zu erzeugen. Mit unserem Ansatz zeigten wir, dass eine begrenzte Kultur zu CAR-T-Zellen mit überlegener Effektorfunktion und Persistenz nach Derisübertragung bei Xenograft-Modellen von Leukämie führt. Hier stellen wir die Ansätze zur zuverlässigen Generierung von CART19-Zellen vor (autologe T-Zellen, die entwickelt wurden, um Anti-CD19-SCFv auszudrücken, die an CD3- und die 4-1BB-Signal-Domains angehängt sind) und enthalten eine detaillierte Beschreibung der Assays, die Einblicke in car T Bioaktivität und Wirksamkeit vor der Adoptionsübertragung geben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir Ansätze zur Messung der Funktion und Wirksamkeit von CAR-T-Zellen, die in unterschiedlichen Intervallen in der Ex-vivo-Kultur geerntet werden. Unsere Methoden bieten umfassende Einblicke in Assays zur Beurteilung der Proliferativen Kapazität sowie der Effektorfunktion in vitro. Wir beschreiben, wie man die AKTIVITÄT von CAR T-Zellen nach Stimulation durch die CAR misst und Xenograft-Modelle von Leukämie mit CAR-T-Zellen detailliert beschreibt, die am Tag 3 gegen Tag 9 ihrer logarithmischen Expans…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise durch die Finanzierung durch Novartis Pharmaceuticals durch eine Forschungsallianz mit der University of Pennsylvania (Michael C. Milone) sowie den St. Baldrick es Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi) unterstützt.
Materials
| Anti CD3/CD28 dynabeads | Thermo Fisher | 40203D | |
| APC Mouse Anti-Human CD8 | BD Biosciences | 555369 | RRID:AB_398595 |
| APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody | BD Biosciences | 560179 | RRID:AB_1645481 |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | |
| BD Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 317444 | RRID:AB_2561866 |
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | BioLegend | 317322 | RRID:AB_2561911 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Life Technolohgies | C34554 | |
| CountBright Absolute Counting Beads, | Invitrogen | C36950 | |
| FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody | BD Pharmingen | 561271 | RRID:AB_10561679 |
| FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD Biosciences | 555346 | RRID:AB_395751 |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Human IL-2 IS, premium grade | Miltenyi | 130-097-744 | |
| L-glutamine | Gibco | 28030-081 | |
| Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux | Perkin Elmer | ||
| LIVE/DEAD Fixable Violet | Molecular Probes | L34964 | |
| Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter | ||
| Na251CrO4 | Perkin Elmer | NEZ030S001MC | |
| Pacific Blue anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325616 | RRID:AB_830689 |
| Pacific Blue anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302223 | |
| PE anti-human CD45RO Antibody | BD Biosciences | 555493 | RRID:AB_395884 |
| PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody | BioLegend | 305610 | RRID:AB_493652 |
| PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody | Beckman Coulter | A54823 | |
| Phenol red-free medium | Gibco | 10373-017 | |
| UltraPure SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
| Via-Probe | BD Biosciences | 555815 | |
| X-VIVO 15 | Gibco | 04-418Q | |
| XenoLight D-Luciferin – K+ Salt | Perkin Elmer | 122799 |
References
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