İmal İmmünoterapi için İmkanerik Antijen Reseptör (CAR) T Hücreleri
Summary
Biz güvenilir şemerik antijen reseptörü oluşturmak için bir yaklaşım tarif (CAR) T hücreleri ve in vitro ve in vivo onların farklılaşma ve fonksiyon test.
Abstract
Benimseyen immünoterapi kanser ve bulaşıcı hastalıkların tedavisi için umut vaat ediyor. Biz şimerik antijen reseptörü ile birincil insan T hücreleri transduce basit bir yaklaşım tarif (CAR) ve onların singen ynuzlu ex vivo genişletmek. Car ekspresyonunun yanı sıra farklılaşma, proliferatif kapasite ve sitoklitik aktiviteyi ölçmek için tahliller de dahilyiz. CAR T hücrelerinde efektör sitokin üretimini ve inflamatuar sitokin salgısını ölçmek için tahlilleri tanımlıyoruz. Yaklaşımımız, evlat edinen immünoterapinin preklinik modelleri için CAR T hücrelerine güvenilir ve kapsamlı bir yöntem sunmaktadır.
Introduction
Şimerik antijen reseptörleri (CAR) farklı tümör antijenlerine karşı T hücrelerini yönlendirmek için umut verici bir yaklaşım sağlar. CAR bir antijen hedef bağlamak sentetik reseptörleri vardır. Kesin kompozisyonları değişken olmakla birlikte, CAR’lar genellikle 3 farklı etki alanı içerir. Hücre dışı etki alanı bir hedef antijene bağlanır ve genellikle ekstrasellüler menteşe ile CAR’a bağlı tek bir zincirantikor parçasından oluşur. T hücre reseptörü (TCR) kompleksinin CD30 zincirinden elde edilen ikinci etki alanı, CAR etkileşiminden sonra T hücre aktivasyonunu teşvik eder. Üçüncü bir kostimulatör etki T hücre fonksiyonu geliştirmek için dahildir, engraftment, metabolizma, ve kalıcılık. B hücreli akut lenfoblastik lösemi (ALL), kronik lenfositik lösemi (KLL) ve multipl miyelom dahil olmak üzere çeşitli hematopoetik malignitelerde CAR T hücre tedavisinin başarısı bu yaklaşımın terapötik sözünü vurgular1,2,3,4,5,6. Son Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) iki CD19-spesifik CAR T hücre tedavileri için onaylar, pediatrik ve genç erişkin ALL ve diffüz büyük B hücreli lenfoma için aksicabtagene ciloleucel için tisagenlecleucel, CAR T hücre tedavisinin çevirili liyakatini güçlendirir.
CAR T tabanlı yaklaşımlar periferik kan, aktivasyon, genetik modifikasyon ve genişleme ex vivo T hücrelerinin izolasyon içerir. Farklılaşma CAR T hücre etkinliğini düzenleyen önemli bir parametredir. Buna göre, ex vivo kültür sırasında T hücre farklılaşmasını kısıtlayan engraft için aşılanmış ürünün yeteneğini artırır, genişletmek, ve devam, evlat edinme transferi aşağıdaki uzun vadeli immüngözetim sağlayan2,7,8,9. T hücreleri şunlardır: naif T hücreleri (Tn), merkezi bellek (Tcm), efektör bellek (Tem), efektör diferansiye (Tte) ve kök hücre belleği (Tscm). Efektör diferansiye T hücreleri güçlü sitolitik yeteneğe sahiptir; ancak, kısa ömürlü ve engraft kötü10,11,12. Buna karşılık, naif T hücreleri ve Tcm dahil olmak üzere daha az diferansiye fenotip ile T hücreleri üstün engraftment ve proliferatif yetenekleri adoptive hücre transferi aşağıdaki sergiler13,14,15,16,17,18. Önceden üretilen üründe toplanan T hücrelerinin bileşimi hastalar arasında değişebilir ve CAR T hücrelerinin terapötik potansiyeli ile ilişkilidir. Başlangıç aferez ürününde naif benzeri immünhefenotip olan T hücrelerinin oranı hem engreftment hem de klinik yanıt ile son derece ilişkilidir19.
Kültür süresi, evlat edinme transferi için hazırlanan CAR T hücrelerinde farklılaşmayı etkileyen önemli bir parametredir. Biz son zamanlarda kısaltılmış bir kültür paradigması20kullanarak üstün kaliteli CAR T hücreleri oluşturmak için bir yaklaşım geliştirdi. Yaklaşımımızı kullanarak, sınırlı kültürün löseminin ksenogreft modellerinde evlat edinici transferi sonrasında üstün efektör işlevi ve kalıcılığı olan CAR T hücrelerine yol açtığını gösterdik. Burada, CART19 hücrelerini (CD3ţ ve 4-1BB sinyal etki alanlarındaki anti-CD19 scFv’yi ifade etmek üzere tasarlanmış otolog T hücreleri) güvenilir bir şekilde üretmek için yaklaşımları savuruyoruz ve evlat edinmeden önce CAR T biyoaktivite ve etkinliği hakkında bilgi sağlayan tahlillerin ayrıntılı bir açıklamasını da ekleyebiliyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada ex vivo kültürü boyunca çeşitli aralıklarla hasat edilen CAR T hücrelerinin işlevini ve etkinliğini ölçmek için yaklaşımları açıklıyoruz. Yöntemlerimiz, proliferatif kapasitenin yanı sıra efektör fonksiyonunu in vitro olarak değerlendirmek üzere tasarlanmış tahliller hakkında kapsamlı bir içgörü sağlar. Car ile stimülasyonu takiben CAR T hücre aktivitesinin nasıl ölçültüldüğü ve logaritmik genleşme fazının 3.
Ex vivo genleşme sırasında far…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen Novartis Pharmaceuticals tarafından Pennsylvania Üniversitesi (Michael C. Milone) ve St. Baldrick Vakfı Bursu (Saba Ghassemi) ile bir araştırma ittifakı aracılığıyla sağlanan finansman la desteklenmiştir.
Materials
| Anti CD3/CD28 dynabeads | Thermo Fisher | 40203D | |
| APC Mouse Anti-Human CD8 | BD Biosciences | 555369 | RRID:AB_398595 |
| APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody | BD Biosciences | 560179 | RRID:AB_1645481 |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | |
| BD Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 317444 | RRID:AB_2561866 |
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | BioLegend | 317322 | RRID:AB_2561911 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Life Technolohgies | C34554 | |
| CountBright Absolute Counting Beads, | Invitrogen | C36950 | |
| FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody | BD Pharmingen | 561271 | RRID:AB_10561679 |
| FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD Biosciences | 555346 | RRID:AB_395751 |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Human IL-2 IS, premium grade | Miltenyi | 130-097-744 | |
| L-glutamine | Gibco | 28030-081 | |
| Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux | Perkin Elmer | ||
| LIVE/DEAD Fixable Violet | Molecular Probes | L34964 | |
| Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter | ||
| Na251CrO4 | Perkin Elmer | NEZ030S001MC | |
| Pacific Blue anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325616 | RRID:AB_830689 |
| Pacific Blue anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302223 | |
| PE anti-human CD45RO Antibody | BD Biosciences | 555493 | RRID:AB_395884 |
| PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody | BioLegend | 305610 | RRID:AB_493652 |
| PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody | Beckman Coulter | A54823 | |
| Phenol red-free medium | Gibco | 10373-017 | |
| UltraPure SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
| Via-Probe | BD Biosciences | 555815 | |
| X-VIVO 15 | Gibco | 04-418Q | |
| XenoLight D-Luciferin – K+ Salt | Perkin Elmer | 122799 |
References
- Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- Kalos, M., et al. T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia. Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73 (2011).
- Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139 (2015).
- Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).
- Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
- Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease. Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).
- Brestrich, G., et al. Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy. American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).
- Savoldo, B., et al. Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs). Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).
- Berger, C., et al. Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates. The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).
- Gattinoni, L., et al. A human memory T cell subset with stem cell-like properties. Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).
- Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).
- Klebanoff, C. A., et al. Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).
- Wang, X., et al. Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice. Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).
- Wang, X., et al. Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer. Oncoimmunology. 5 (1), e1072671 (2016).
- Fraietta, J., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).
- Ghassemi, S., et al. Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells. Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).
- Milone, M. C., et al. Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).
- Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
- Cui, G., et al. IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity. Cell. 161 (4), 750-761 (2015).
- Xu, Y., et al. Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15. Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).
- Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies. Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323 (2016).
