Fremstilling af Chimeric antigen receptor (bil) T-celler til adoptiv immunterapi
Summary
Vi beskriver en tilgang til pålideligt at generere chimeriske antigen receptor (bil) T-celler og teste deres differentiering og funktion in vitro og in vivo.
Abstract
Adoptiv immunterapi holder løfte om behandling af kræft og smitsomme sygdomme. Vi beskriver en enkel tilgang til transduce primære humane T-celler med chimerisk antigen receptor (CAR) og udvider deres afkom ex vivo. Vi medtager assays til måling af BILEKSPRESSION samt differentiering, proliferativ kapacitet og cytolytisk aktivitet. Vi beskriver assays til måling af Effector cytokin produktion og inflammatorisk cytokinsekretion i bil T-celler. Vores tilgang giver en pålidelig og omfattende metode til kultur bil T celler for prækliniske modeller af adoptiv immunterapi.
Introduction
Chimeric antigen receptorer (biler) giver en lovende tilgang til at omdirigere T-celler mod forskellige tumor antigener. Biler er syntetiske receptorer, der binder et antigen mål. Mens deres præcise sammensætning er variabel, biler indeholder generelt 3 forskellige domæner. Det ekstracellulære domæne dirigerer binding til et målantigen og består typisk af et enkelt kæde antistoffragment, der er knyttet til bilen via et ekstracellulært hængsel. Det andet domæne, almindeligvis afledt af CD3ζ kæden af T Cell receptor (TCR) kompleks, fremmer T celle aktivering efter bil engagement. En tredje costimulatory domæne er inkluderet for at forbedre T celle funktion, engraftment, metabolisme, og vedholdenhed. Succesen af bil T celleterapi i forskellige hæmatopoietiske maligniteter herunder B-celle akut lymfoblastær leukæmi (alle), kronisk lymfocytisk leukæmi (CLL) og multipelt myelomatose fremhæver den terapeutiske løfte om denne tilgang1,2,3,4,5,6. De seneste godkendelser af fødevare-og lægemiddel administration (FDA) for to CD19-specifikke CAR T-celle terapier, tisagenlecleucel til pædiatriske og unge voksne alle og axicabtagene ciloleucel til diffus stor B-celle-lymfom, forstærker den translationelle fortjeneste af CAR T-celleterapi.
BIL T-baserede tilgange involverer isolering af T-celler fra perifert blod, aktivering, genetisk modifikation, og ekspansion ex vivo. Differentiering er en vigtig parameter regulerer bil T celle effektivitet. Derfor, at begrænse T Celledifferentiering under ex vivo kultur øger evnen af det inbrugte produkt til at forankret, udvide, og fortsætter, at give langsigtet immun overvågning efter adoptiv overførsel2,7,8,9. T-cellerne består af flere forskellige delsæt, herunder: naive T-celler (TN), central hukommelse (TCM), Effector-hukommelse (tem), Effector-differentieret (tte) og stamcelle hukommelse (TSCM). Effector differentierede T-celler har potent cytolytisk evne; men de er korte levede og forankret dårligt10,11,12. I modsætning, t-celler med en mindre differentieret fænotype, herunder naive T-celler og TCM udviser overlegne engraftment og proliferativ evner efter adoptiv celle overførsel13,14,15,16,17,18. Sammensætningen af de indsamlede T-celler i det præproducerede produkt kan variere på tværs af patienterne og korrelerer med det terapeutiske potentiale af bil-T-celler. Andelen af T-celler med en naiv-lignende immunophenotype i Start aferese-produktet er meget korreleret med både engraftment og klinisk respons19.
Kultur varighed er en vigtig parameter, der påvirker differentiering i bil T-celler forberedt til adoptivoverførsel. Vi har for nylig udviklet en tilgang til at generere overlegen kvalitet bil T-celler ved hjælp af en forkortet kultur paradigme20. Ved hjælp af vores tilgang, vi viste, at begrænset kultur giver anledning til bil T celler med overlegen Effector funktion og persistens efter adoptiv overførsel i xenograft modeller af leukæmi. Her præsenterer vi de tilgange til pålideligt generere CART19 celler (autologous T-celler konstrueret til at udtrykke anti-CD19 scFv knyttet til CD3ζ og 4-1BB signalering domæner) og omfatte en detaljeret beskrivelse af de analyser, der giver indsigt i bil T Bioaktivitet og effektivitet forud for adoptivoverførsel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi metoder til at målefunktionen og effekten af de bil-T-celler, som høstes med varierende intervaller i hele ex vivo-kulturen. Vores metoder giver omfattende indsigt i assays designet til at vurdere proliferativ kapacitet samt Effector funktion in vitro. Vi beskriver, hvordan man måler bil T celle aktivitet efter stimulation gennem bilen og detalje xenograft modeller af leukæmi ved hjælp af bil T celler høstet på dag 3 vs dag 9 i deres logaritmiske ekspansion fase.
Der er…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist støttet gennem finansiering fra Novartis Pharmaceuticals gennem en forskningsalliance med University of Pennsylvania (Michael C. Milone) samt St. Baldricks Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi).
Materials
| Anti CD3/CD28 dynabeads | Thermo Fisher | 40203D | |
| APC Mouse Anti-Human CD8 | BD Biosciences | 555369 | RRID:AB_398595 |
| APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody | BD Biosciences | 560179 | RRID:AB_1645481 |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | |
| BD Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 317444 | RRID:AB_2561866 |
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | BioLegend | 317322 | RRID:AB_2561911 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Life Technolohgies | C34554 | |
| CountBright Absolute Counting Beads, | Invitrogen | C36950 | |
| FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody | BD Pharmingen | 561271 | RRID:AB_10561679 |
| FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD Biosciences | 555346 | RRID:AB_395751 |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Human IL-2 IS, premium grade | Miltenyi | 130-097-744 | |
| L-glutamine | Gibco | 28030-081 | |
| Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux | Perkin Elmer | ||
| LIVE/DEAD Fixable Violet | Molecular Probes | L34964 | |
| Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter | ||
| Na251CrO4 | Perkin Elmer | NEZ030S001MC | |
| Pacific Blue anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325616 | RRID:AB_830689 |
| Pacific Blue anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302223 | |
| PE anti-human CD45RO Antibody | BD Biosciences | 555493 | RRID:AB_395884 |
| PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody | BioLegend | 305610 | RRID:AB_493652 |
| PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody | Beckman Coulter | A54823 | |
| Phenol red-free medium | Gibco | 10373-017 | |
| UltraPure SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
| Via-Probe | BD Biosciences | 555815 | |
| X-VIVO 15 | Gibco | 04-418Q | |
| XenoLight D-Luciferin – K+ Salt | Perkin Elmer | 122799 |
References
- Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- Kalos, M., et al. T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia. Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73 (2011).
- Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139 (2015).
- Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).
- Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
- Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease. Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).
- Brestrich, G., et al. Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy. American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).
- Savoldo, B., et al. Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs). Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).
- Berger, C., et al. Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates. The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).
- Gattinoni, L., et al. A human memory T cell subset with stem cell-like properties. Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).
- Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).
- Klebanoff, C. A., et al. Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).
- Wang, X., et al. Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice. Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).
- Wang, X., et al. Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer. Oncoimmunology. 5 (1), e1072671 (2016).
- Fraietta, J., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).
- Ghassemi, S., et al. Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells. Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).
- Milone, M. C., et al. Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).
- Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
- Cui, G., et al. IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity. Cell. 161 (4), 750-761 (2015).
- Xu, Y., et al. Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15. Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).
- Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies. Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323 (2016).
