Fremstilling chimeric antigen reseptor (CAR) T celler for adoptiv immunterapi
Summary
Vi beskriver en tilnærming til pålitelig generering av chimeric antigen reseptor (CAR) T-celler og teste deres differensiering og funksjon in vitro og in vivo.
Abstract
Adoptiv immunterapi holder løftet for behandling av kreft og smittsomme sykdommer. Vi beskriver en enkel tilnærming til overfører primære menneskelige T-celler med chimeric antigen reseptor (CAR) og utvide sin avkom ex vivo. Vi inkluderer analyser for å måle CAR-uttrykk, i tillegg til differensiering, proliferativ kapasitet og cytolytisk aktivitet. Vi beskriver analysene for å måle effektor cytokin produksjon og inflammatorisk cytokin sekresjon i CAR T-celler. Vår tilnærming gir en pålitelig og omfattende metode til kultur CAR T-celler for prekliniske modeller av adoptiv immunterapi.
Introduction
Chimeric antigen reseptorer (CARs) gir en lovende tilnærming til å omdirigere T celler mot distinkte tumor antigener. Biler er syntetiske reseptorer som binder et antigen mål. Mens deres eksakte sammensetning er variabel, biler vanligvis inneholder 3 forskjellige domener. Ekstracellulære domenet dirigerer binding til et mål antigen og består vanligvis av ett enkelt kjede antistoff fragment knyttet til bilen via en ekstracellulære hengsel. Den andre domene, som vanligvis stammer fra CD3ζ kjeden av T celle reseptor (TCR) komplekse, fremmer T celle aktivering følgende CAR engasjement. En tredje costimulatory domene er inkludert for å forbedre T celle funksjon, engraftment, metabolisme, og utholdenhet. Suksessen til bil T Cell Therapy i ulike blodkreft ondartet inkludert B Cell akutt lymfatisk leukemi (alle), kronisk lymfatisk leukemi (CLL) og flere myelom fremhever den terapeutiske løftet om denne tilnærmingen1,2,3,4,5,6. De siste Food and Drug Administration (FDA) godkjenninger for to CD19-spesifikke CAR T celle terapier, tisagenlecleucel for pediatric og unge voksne alle og axicabtagene ciloleucel for diffuse store B-celle lymfom, forsterker translational fortjeneste av CAR T celle terapi.
BIL T-baserte tilnærminger innebære isolering av T-celler fra perifert blod, aktivering, genetisk modifisering, og ekspansjon ex vivo. Differensiering er en viktig parameter som regulerer CAR T-celle effekt. Følgelig, begrenser T celle differensiering under ex vivo kultur forbedrer evnen til tilført produktet for å engraft, utvide, og vedvarer, gir lang tids immunosurveillance etter adoptiv overføring2,7,8,9. T-celler består av flere forskjellige delsett, inkludert: naive T-celler (TN), sentral minne (TCM), effektor minne (TEM), effektor differensiert (tte) og Stamcelle minne (TSCM). Effektor differensiert T-celler har potent cytolytisk evne; men de er korte levd og engraft dårlig10,11,12. I kontrast T celler med en mindre differensiert fenotype inkludert naiv T celler og TCM utstillingen overlegen engraftment og proliferativ evner etter adoptiv celle overføring13,14,15,16,17,18. Sammensetningen av de innsamlede T-cellene i det premanufactured produktet kan variere mellom pasienter og samsvarer med det terapeutiske potensialet til CAR T-celler. Andelen T-celler med en naiv-lignende immunophenotype i Start aferese produktet er svært korrelert med både engraftment og klinisk respons19.
Kultur varighet er en viktig parameter som påvirker differensiering i CAR T-celler forberedt for adoptiv overføring. Vi har nylig utviklet en tilnærming til å generere overlegen kvalitet CAR T-celler ved hjelp av en forkortet kultur paradigme20. Ved hjelp av vår tilnærming, viste vi at begrenset kultur gir opphav til CAR T-celler med overlegen effektor funksjon og utholdenhet etter adoptiv overføring i xenograft modeller av leukemi. Her presenterer vi tilnærminger til pålitelig generere CART19 celler (autologous T-celler konstruert for å uttrykke anti-CD19 scFv knyttet til CD3ζ og 4-1BB signalering domener) og inkluderer en detaljert beskrivelse av analysene som gir innsikt i CAR T-bioactivity og effekt før adoptiv overføring.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi tilnærminger for å målefunksjonen og effekten av CAR T-celler høstes med varierende intervaller gjennom ex vivo kultur. Våre metoder gir omfattende innsikt i analyser som er utformet for å vurdere proliferativ kapasitet så vel som effektor funksjon in vitro. Vi beskriver hvordan du måler CAR T celle aktivitet etter stimulering gjennom bilen og detalj xenograft modeller av leukemi bruker CAR T celler høstet på dag 3 vs dag 9 av deres logaritmisk ekspansjons fase.
Det …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet delvis gjennom finansiering levert av Novartis Pharmaceuticals gjennom en forsknings allianse med University of Pennsylvania (Michael C. Milone) samt St. Baldrick ‘ s Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi).
Materials
| Anti CD3/CD28 dynabeads | Thermo Fisher | 40203D | |
| APC Mouse Anti-Human CD8 | BD Biosciences | 555369 | RRID:AB_398595 |
| APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody | BD Biosciences | 560179 | RRID:AB_1645481 |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | |
| BD Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 317444 | RRID:AB_2561866 |
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | BioLegend | 317322 | RRID:AB_2561911 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Life Technolohgies | C34554 | |
| CountBright Absolute Counting Beads, | Invitrogen | C36950 | |
| FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody | BD Pharmingen | 561271 | RRID:AB_10561679 |
| FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD Biosciences | 555346 | RRID:AB_395751 |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Human IL-2 IS, premium grade | Miltenyi | 130-097-744 | |
| L-glutamine | Gibco | 28030-081 | |
| Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux | Perkin Elmer | ||
| LIVE/DEAD Fixable Violet | Molecular Probes | L34964 | |
| Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter | ||
| Na251CrO4 | Perkin Elmer | NEZ030S001MC | |
| Pacific Blue anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325616 | RRID:AB_830689 |
| Pacific Blue anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302223 | |
| PE anti-human CD45RO Antibody | BD Biosciences | 555493 | RRID:AB_395884 |
| PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody | BioLegend | 305610 | RRID:AB_493652 |
| PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody | Beckman Coulter | A54823 | |
| Phenol red-free medium | Gibco | 10373-017 | |
| UltraPure SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
| Via-Probe | BD Biosciences | 555815 | |
| X-VIVO 15 | Gibco | 04-418Q | |
| XenoLight D-Luciferin – K+ Salt | Perkin Elmer | 122799 |
References
- Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- Kalos, M., et al. T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia. Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73 (2011).
- Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139 (2015).
- Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).
- Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
- Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease. Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).
- Brestrich, G., et al. Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy. American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).
- Savoldo, B., et al. Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs). Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).
- Berger, C., et al. Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates. The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).
- Gattinoni, L., et al. A human memory T cell subset with stem cell-like properties. Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).
- Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).
- Klebanoff, C. A., et al. Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).
- Wang, X., et al. Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice. Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).
- Wang, X., et al. Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer. Oncoimmunology. 5 (1), e1072671 (2016).
- Fraietta, J., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).
- Ghassemi, S., et al. Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells. Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).
- Milone, M. C., et al. Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).
- Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
- Cui, G., et al. IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity. Cell. 161 (4), 750-761 (2015).
- Xu, Y., et al. Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15. Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).
- Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies. Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323 (2016).
