Vi beskriver en metod för att på ett tillförlitligt sätt generera chimär antigen receptor (Car) T-celler och testa deras differentiering och funktion in vitro och in vivo.
Adoptiv immunterapi håller löfte för behandling av cancer och infektionssjukdomar. Vi beskriver ett enkelt sätt att transduce primära mänskliga T-celler med chimär antigen receptor (bil) och expandera sin avkomma ex vivo. Vi inkluderar analyser för att mäta bil uttryck samt differentiering, proliferativ kapacitet och cytolytisk aktivitet. Vi beskriver analyser för att mäta effektor cytokin produktion och inflammatorisk cytokin sekretion i bil T celler. Vår metod ger en tillförlitlig och heltäckande metod för att odla bil T-celler för prekliniska modeller av adoptiv immunterapi.
Chimeric antigen receptorer (bilar) ger en lovande metod för att omdirigera T-celler mot olika tumörantigener. Bilar är syntetiska receptorer som binder ett antigen mål. Medan deras exakta sammansättning varierar, innehåller bilar i allmänhet 3 distinkta domäner. Den extracellulära domänen leder bindningen till ett målantigen och består vanligtvis av en enda kedja antikropps fragment kopplade till bilen via ett extracellulärt gångjärn. Den andra domänen, som vanligen härleds från CD3ζ-kedjan av T-cellreceptorn (TCR)-komplexet, främjar T-cellernas aktivering efter bil engagemang. En tredje Co-domän ingår för att förbättra T-cells funktion, engrafktion, metabolism, och uthållighet. Framgången för bil T-cellterapi i olika hematopoietiska maligniteter inklusive B-cell akut lymfatisk leukemi (alla), kronisk lymfatisk leukemi (KLL) och multipel myelom belyser det terapeutiska löftet om detta tillvägagångssätt1,2,3,4,5,6. Den senaste Food and Drug Administration (FDA) godkännanden för två CD19-specifika bil T cellterapier, tisagenlecleucel för pediatriska och unga vuxna alla och axicabtagene ciloleucel för diffusa stora B-cellslymfom, förstärker den translationella förtjänst av bil T cellterapi.
BIL T-baserade metoder innebär isolering av T-celler från perifert blod, aktivering, genetisk modifiering, och expansion ex vivo. Differentiering är en viktig parameter som reglerar BILENS T-cellseffekt. Följaktligen, begränsa T celldifferentiering under ex vivo kultur ökar förmågan hos den infunderade produkten att engraft, expandera, och kvarstår, ger långsiktig immunoövervakning efter adoptiv överföring2,7,8,9. T-celler består av flera distinkta undergrupper inklusive: naiva T-celler (TN), centralminne (TCM), effektor Memory (TEM), effektor differentierad (TTE) och stamcells minne (TSCM). Effector differentierade T-celler har potent cytolytisk förmåga; men de är kortlivade och att dåligt10,11,12. Däremot, t-celler med en mindre differentierad fenotyp inklusive naiva T-celler och TCM uppvisar överlägsen engrafering och proliferativa förmågor efter adoptiv cell överföring13,14,15,16,17,18. Sammansättningen av de insamlade T-cellerna i den färdigtillverkade produkten kan variera mellan olika patienter och korrelerar med den terapeutiska potentialen hos bil T-celler. Andelen T-celler med en naiv-liknande immunophenotyp i Start aferes produkten är starkt korrelerad med både inympelse och kliniskt svar19.
Kulturens varaktighet är en viktig parameter som påverkar differentieringen i bil T-celler som förberetts för adoptiv överföring. Vi har nyligen utvecklat en strategi för att generera överlägsen kvalitet bil T-celler med hjälp av en förkortad kultur paradigm20. Med hjälp av vår strategi visade vi att begränsad kultur ger upphov till bil T-celler med överlägsen effektor funktion och uthållighet efter adoptiv överföring i xenograft modeller av leukemi. Här presenterar vi metoder för att tillförlitligt generera CART19 celler (autolog T-celler konstruerade för att uttrycka anti-CD19 scFv bifogas CD3ζ och 4-1BB signalering domäner) och innehåller en detaljerad beskrivning av de analyser som ger insikt i bil T bioaktivitet och effekt före adoptiv överföring.
Här beskriver vi metoder för att mäta funktion och effekt av bil T-celler som skördats med varierande intervall i ex vivo-kulturen. Våra metoder ger omfattande inblick i analyser som utformats för att bedöma proliferativ kapacitet samt effektor funktion in vitro. Vi beskriver hur man mäter bil T cell aktivitet efter stimulering genom bilen och detalj xenograft modeller av leukemi med hjälp av bil T-celler skördas på dag 3 vs dag 9 i deras logaritmisk expansionsfas.
Det finns inneboe…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes delvis genom finansiering från Novartis Pharmaceuticals genom en forskningsallians med University of Pennsylvania (Michael C. Milone) samt St. Baldrick ‘ s Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi).
Anti CD3/CD28 dynabeads | Thermo Fisher | 40203D | |
APC Mouse Anti-Human CD8 | BD Biosciences | 555369 | RRID:AB_398595 |
APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody | BD Biosciences | 560179 | RRID:AB_1645481 |
BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | |
BD Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 317444 | RRID:AB_2561866 |
Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | BioLegend | 317322 | RRID:AB_2561911 |
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Life Technolohgies | C34554 | |
CountBright Absolute Counting Beads, | Invitrogen | C36950 | |
FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody | BD Pharmingen | 561271 | RRID:AB_10561679 |
FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD Biosciences | 555346 | RRID:AB_395751 |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
Human IL-2 IS, premium grade | Miltenyi | 130-097-744 | |
L-glutamine | Gibco | 28030-081 | |
Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux | Perkin Elmer | ||
LIVE/DEAD Fixable Violet | Molecular Probes | L34964 | |
Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter | ||
Na251CrO4 | Perkin Elmer | NEZ030S001MC | |
Pacific Blue anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325616 | RRID:AB_830689 |
Pacific Blue anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302223 | |
PE anti-human CD45RO Antibody | BD Biosciences | 555493 | RRID:AB_395884 |
PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody | BioLegend | 305610 | RRID:AB_493652 |
PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody | Beckman Coulter | A54823 | |
Phenol red-free medium | Gibco | 10373-017 | |
UltraPure SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
Via-Probe | BD Biosciences | 555815 | |
X-VIVO 15 | Gibco | 04-418Q | |
XenoLight D-Luciferin – K+ Salt | Perkin Elmer | 122799 |