चावल की एक लिंग आबादी में पिघल उच्च संकल्प द्वारा उत्परिवर्तनों की पहचान
Summary
इस आलेख में, हम प्रोटोकॉल जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन पिघलने विश्लेषण (HRM)-आधारित लक्ष्य प्रेरित स्थानीय Lesions जीनोम्स में (TILLING) के रूप में वर्णित है प्रस्तुत करते हैं। यह विधि डीएनए डुप्लेक्स के पिघलने के दौरान फ्लोरोसेंट परिवर्तन का उपयोग करती है और प्रविष्टि/विलोपन (इंडेल) और एकल आधार सबस्टिशन (एसबीएस) दोनों की उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है।
Abstract
लक्ष्य प्रेरित स्थानीय Lesions में जीनोम्स (TILLING) प्रेरित उत्परिवर्तनों के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए रिवर्स आनुवंशिकी की एक रणनीति है. हालांकि, TILLING प्रणाली प्रविष्टि के लिए कम प्रयोज्यता है / विलोपन (इंडेल) का पता लगाने और पारंपरिक TILLING अधिक जटिल कदम की जरूरत है, सीईएल मैं nuclease पाचन और जेल electrophoresis की तरह. थ्रूपुट और चयन दक्षता में सुधार करने के लिए, और दोनों Indels और एकल आधार substitions (SBSs) संभव की स्क्रीनिंग बनाने के लिए, एक नया उच्च संकल्प पिघलने (HRM) आधारित TILLING प्रणाली विकसित की है. यहाँ, हम एक विस्तृत HRM-TILLING प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और उत्परिवर्तन स्क्रीनिंग में इसके आवेदन को दिखाते हैं। इस विधि उच्च तापमान पर डबल-स्ट्रेंड डीएनए के विकृतीकरण को मापने के द्वारा पीसीआर amplicons के उत्परिवर्तनों का विश्लेषण कर सकते हैं। HRM विश्लेषण सीधे अतिरिक्त संसाधन के बिना पोस्ट-पीसीआर किया जाता है। इसके अलावा, एक सरल, सुरक्षित और तेजी से (एसएसएफ) डीएनए निष्कर्षण विधि दोनों Indels और SBS की पहचान करने के लिए एचआरएम-टिलिंग के साथ एकीकृत है। इसकी सादगी, मजबूती और उच्च थ्रूपुट यह चावल और अन्य फसलों में उत्परिवर्तन स्कैनिंग के लिए संभावित रूप से उपयोगी बनाते हैं।
Introduction
उत्परिवर्ती संयंत्र कार्यात्मक जीनोमिक्स अनुसंधान और नई किस्मों के प्रजनन के लिए महत्वपूर्ण आनुवंशिक संसाधन हैं। एक आगे आनुवंशिकी दृष्टिकोण (यानी उत्परिवर्ती चयन से जीन क्लोनिंग या विविधता के विकास के लिए) के बारे में प्रेरित उत्परिवर्तनों के उपयोग के लिए मुख्य और एकमात्र विधि के रूप में इस्तेमाल किया 20 साल पहले. एक उपन्यास रिवर्स आनुवंशिकी विधि का विकास, TILLING (Targeting प्रेरित स्थानीय Lesions जीनोम्स में) McCallum एट अल द्वारा1 एक नया प्रतिमान खोला और यह तब से पशु और संयंत्र प्रजातियों की एक बड़ी संख्या में लागू किया गया है2. TILLING विशेष रूप से लक्षण है कि तकनीकी रूप से मुश्किल है या निर्धारित किया जा करने के लिए महंगा कर रहे हैं प्रजनन के लिए उपयोगी है (उदाहरण के लिए, रोग प्रतिरोध, खनिज सामग्री).
TILLING शुरू में रासायनिक mutagens द्वारा प्रेरित स्क्रीनिंग बिंदु उत्परिवर्तनों के लिए विकसित किया गया था (उदाहरण के लिए, ईएमएस1,3). यह निम्नलिखित कदम शामिल हैं: एक टिलरिंग आबादी की स्थापना (ओं); डीएनए तैयारी और अलग-अलग पौधों का पूलिंग; पीसीआर लक्ष्य डीएनए टुकड़ा के प्रवर्धन; HEteroduplexes गठन विकृतीकरण और पीसीआर amplicons और सीईएल मैं nuclease द्वारा दरार के अनीलन द्वारा; और उत्परिवर्ती व्यक्तियों और उनके विशिष्ट आणविक घावों की पहचान3,4. हालांकि, इस विधि अभी भी अपेक्षाकृत जटिल है, समय लगता है, और कम throughput. इसे और अधिक कुशल और उच्च थ्रूपुट के साथ बनाने के लिए, कई संशोधित टिलिंग विधियों को विकसित किया गया है, जैसे विलोपन टिलिंग (डी-टिलरिंग) (तालिका 1)1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.
एचआरएम वक्र विश्लेषण, जो डीएनए डुप्लेक्स के पिघलने के दौरान फ्लोरोसेंट परिवर्तन पर आधारित है, उत्परिवर्तन स्क्रीनिंग और जीनोटाइपिंग13के लिए एक सरल, लागत प्रभावी, और उच्च थ्रूपुट विधि है। एचआरएम पहले से ही ईएमएस mutagenesis14द्वारा प्रेरित एसबीएस उत्परिवर्तनों की जांच के लिए एचआरएम आधारित टिलरिंग (एचआरएम-टिलरिंग) सहित संयंत्र अनुसंधान में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है। यहाँ, हम चावल में गामा (जेड) किरणों से प्रेरित उत्परिवर्तनों (दोनों Indel और एसबीएस) की स्क्रीनिंग के लिए विस्तृत HRM-TILLING प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया।
Protocol
Representative Results
Discussion
TILLING जीन कार्यात्मक विश्लेषण और फसल प्रजनन के लिए प्रेरित उत्परिवर्तनों की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली रिवर्स आनुवंशिक उपकरण साबित हुआ है. कुछ लक्षण आसानी से मनाया या निर्धारित नहीं के लिए, उच्च throughput …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (सं. 2016YFD0102103) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (No.31701394) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 2× Taq plus PCR Master Mix | Tiangen, China | KT201 | PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification |
| 96-well plate | Bio-rad, America | MSP-9651 | Specific plate for PCR in HRM analysis |
| Mastercycler nexus | Eppendorf, German | 6333000073 | PCR amplification |
| LightScanner | Idaho Technology, USA | LCSN-ASY-0011 | For fluorescence sampling and processing |
| CALL-IT 2.0 | Idaho Technology, USA | For analysis of the fluorescence change | |
| EvaGreen | Biotium, USA | 31000-T | Fluorescence dye of HRM |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific, USA | ND2000 | For DNA quantification |
References
- McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).
- Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding. Molecular Breeding. 37 (3), 40 (2017).
- Till, B. J., et al. Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING. Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).
- Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single nucleotide mutation discovery. The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).
- Comai, L., et al. Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling. The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).
- Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicagotruncatula. Plant Physiology. 151 (3), 1077 (2009).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis. Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).
- Colasuonno, P., et al. DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population. BMC Genetics. 17 (1), 43 (2016).
- Tsai, H., et al. Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing. Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).
- Kumar, A. P. K., et al. TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops. Molecular Breeding. 37, 14 (2017).
- Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor. BMC Plant Biology. 9, 143 (2009).
- Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations. Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).
- Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).
- Lochlainn, S. O., et al. High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes. Plant Methods. 7, 43 (2011).
- Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. Laboratory manual for physiological rice. The International Rice Research Institute. , (1976).
- Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China. Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).
- Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide. Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).
- Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control. Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).
- Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. High-resolution melting-based tilling of γ ray-induced mutations in rice. Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).
- Acanda, Y., Óscar, M., Prado, M. J., González, M. V., Rey, M. EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine. Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).
- Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice. Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).
- Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. Frequency and type of inheritable mutations induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing. Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905 (2016).
