Summary
Här presenterar vi en mekanisk dissociation protokoll för att snabbt isolera makrofager från dorsala root ganglion för fenotypning och funktionell analys.
Abstract
Det finns växande intressen att studera molekylära och cellulära interaktioner mellan immunceller och sensoriska nervceller i dorsala root ganglier efter perifer nervskada. Perifera monocytiska celler, inklusive makrofager, är kända för att reagera på en vävnadsskada genom fagocytos, antigen presentation, och cytokin release. Framväxande bevis har implierat bidraget av dorsala root ganglier makrofager till neuropatisk smärt utveckling och axonal reparation i samband med nervskada. Snabbt fenotypning (eller "snabb isolering av") svaret av dorsala root ganglier makrofager i samband med nervskada önskas för att identifiera de okända neuroimmunfaktorerna. Här visar vi hur vårt labb snabbt och effektivt isolerar makrofager från dorsala rotganglier med hjälp av ett enzymfritt mekaniskt dissociationprotokoll. Proverna hålls på is hela för att begränsa cellulära stress. Detta protokoll är mycket mindre tidskrävande jämfört med det vanliga enzymatiska protokollet och har rutinmässigt använts för vår Fluorescensaktiverade cell sorterings analys.
Introduction
Det finns nu betydande belägg för att immunceller bidrar till neuropatisk smärta efter perifer nervskada1,2. Perifera monocytiska celler, inklusive mogna makrofager, är kända för att reagera på vävnadsskada och systemisk infektion genom fagocytos, antigen presentation, och cytokin release. Parallellkoppling av nervskada-inducerad mikroglia aktiveringen i ryggraden dorsala horn, makrofager i dorsala root ganglier (DRG) också expandera signifikant efter nervskada3,4. Särskilt, det finns växande intressen att avgöra om makrofager bidra till neuropatisk smärta utveckling efter perifer nervskada genom att interagera med sensoriska nervceller i DRG5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11. Dessutom, nyare studier också impalerar bidraget av DRG makrofager i axonal reparation efter nervskada12,13. En annan studie tyder vidare på att makrofage subpopulationer (dvs CD11b+Ly6CHi och CD11b+Ly6CLow/- cells) kan spela en annan roll i den mekaniska överkänslighet14. Därför, snabbt fenotypning svaret av DRG makrofager i samband med nervskada kan hjälpa oss att identifiera Neuroimmunologiska faktorer som bidrar till neuropatisk smärta.
Konventionellt, protokollet att isolera makrofager i DRG innebär flera steg inklusive enzymatisk nedbrytning15,16. Tekniken är ofta tidskrävande och kan bli kostsam för storskaliga experiment. Även om mild matsmältning med kollagenas typ II (4 mg/ml) och dispas typ II (4,7 mg/ml) för 20 min rekommenderades tidigare15, är det tänkbart att celler efter exponering för detta enzym är benägna att cellskada eller celldöd, vilket kan leda till låg Avkastning. Dessutom kan skillnaden i kvaliteten på enzymer från parti till parti ytterligare påverka effektiviteten i denna process. Ännu viktigare, makrofager utsätts för enzym nedbrytning kan vara oönskat stimuleras och därmed kan vara mycket olika från in-vivo status. Förändringarna kan potentiellt komplicera resultatet av den funktionella studien.
Här beskriver vi ett enzymfritt protokoll för att snabbt isolera DRG-makrofager vid 4 ° c med mekanisk dissociation. Proverna hålls på is för att begränsa cellulär stress. Som ett resultat, vårt tillvägagångssätt ger en fördel att bibehålla konsekvensen av isoleringen, och de isolerade cellerna är förmodligen friskare och mindre stimulerade. Vi presenterar ytterligare bevis för att validera kvaliteten på de isolerade cellerna med Fluorescensaktiverad cell sortering (FACS) analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittén vid University of California San Francisco och genomfördes i enlighet med NIH guide för vård och användning av försöksdjur.
1. samla lumbal DRG från experimentella möss
- Innan försöket påbörjas, Förbered arbetslösningen av densitetsgradientmediet (t. ex. Percoll) genom att blanda 9 volymer av mediet med 1 volym ca+ +/mg+ +-fri 10X Hbss. Håll den på is.
- Anesthetize musen med 2,5% Avertin. Bekräfta att djuret är helt sövda av bristen på svar på Hind Paw nypa.
Anmärkning: både manliga och kvinnliga möss i åldrarna 6-8 veckor användes. - Perfuse musen transcardially med 10 mL förkyld 1x PBS.
- Placera musen i ryggläge med fyra tassar säkrade med tejpen inuti en kemisk draghuv. Lyft huden under revbenen av tång, och göra ett litet snitt med kirurgisk sax för att exponera levern och membranet.
- Fortsätt att använda sax för att skära membranet och bröstkorgen, öppna pleurautgjutning hålighet för att exponera det slående hjärtat.
- Snabbt klippa rätt förmaksflimmer bihang med Iris sax. När blödningen noteras, sätt in en 30 G nål i den bakre änden av vänster kammare, och sakta injicera 10 mL förkyld 1x PBS att parfymera djuret.
- Utför dorsala laminektomi15 på musen placeras på liggande position.
Obs: om cellkultur planeras, spraya musen med 70% etanol före snitt och använda försteriliserade kirurgiska instrument för dissektion.- Använd en storlek 11 skalpell att göra en längsgående laterala djupa snitt från bröstkorg regionen ner till sakrala regionen. Ta bort huden av saxen för att exponera dorsala muskellagret.
- Använd Friedman-Pearson Rongeur att dra bort bindväv och muskler tills lumbosakrala ryggraden processer och bilaterala tvärgående processer exponeras.
- Använd en Noyes fjäder sax för att försiktigt öppna den dorsala ryggraden, sedan byta till en Friedman-Pearson Rongeur att ta bort vertebrala ben att exponera ryggmärgen med intakt spinal nerver bifogas.
- Noggrant dissekera ipsilaterala och kontralaterala ländryggen DRG (L4/L5 DRG i vår studie) och placera den i 1 mL iskall ca+ +/mg+ +-fri 1x Hbss i en dounce vävnad Homogenisatorer. Nu är vävnaderna redo för steg 2.
Anmärkning: trimma spinal nerven bifogas DRG om möjligt.
2. Isolera enstaka celler från mus ländryggen DRG
- Homogenisera DRG vävnad med en lös mortelstöt i Dounce Homogenisatorer 20-25 gånger.
- Placera en steril 70 μm nylon cell SIL i ett sterilt 50 mL koniskt rör. Blöt cellen SIL med 800 μL av iskalla 1x HBSS, och genomflödet samlas i det koniska röret.
- Samla homogeniserade vävnad suspensionen från Homogenisatorer med hjälp av en pipett och passera genom våt 70 μm nylon cell SIL i 50 mL koniska röret.
- Skölj homogenisatorn två gånger med 800 μL av iskalla 1x HBSS och häll sedan i samma 50 mL koniska rör med cellsil för att öka utbytet.
- Tillsätt 1,5 mL jämställda iskall isoton densitet gradient medium (bereds i steg 1,1) i en steril 5-mL polystyren FACS röret.
- Överför cellens homogena från 50 mL koniska röret (i steg 2,4) till FACS-röret, blanda väl med densitetsgradienten medium genom Pipettera upp och ner. Tillsätt ytterligare 500 μL 1x HBSS för att täta toppen.
- Pelleten cellerna genom centrifugering vid 800 x g i 20 min vid 4 ° c.
- Aspirera försiktigt på supernatanten som innehåller myelin i mediet utan att störa cellpelleten i botten av FACS-röret.
- Omsuspendera cellerna i PBS-eller FACS-bufferten som innehåller 5% fetalt bovint serum (FBS) för FACS-analys.
Obs: minst 50 000 till 100 000 celler förväntas från L4/L5 DRG av en mus.- Omsuspendera de mekaniskt isolerade DRG-cellerna (L4/L5) i 100 μL PBS med 5% fetalt bovint serum och inkubera sedan med α-Mouse CX3CR1-APC-antikropp (1:2000) i mörker vid 4 ° c i 1 h.
- Tvätta cellerna med 5 mL PBS en gång; Centrifugera cellerna 360 x g i 8 min vid 4 ° c.
- Aspirera på supernatanten, sedan Omsuspendera cellpelleten i 300 μL PBS för FCAS-analys. Om cell sortering planeras, Omsuspendera cellerna i FACS-bufferten i stället.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att validera de isolerade cellerna valde vi först makrofagen fas-inducerad apoptos (MAFIA) transgena möss17. Denna linje uttrycker ett läkemedel-inducerbara FK506-bindande protein (FKBP)-fas självmord fusion Gene och grönt fluorescerande protein (eGFP) under kontroll av arrangören av CSF1 receptor (CSF1R), som uttryckligen uttrycks i både makrofager och microglia. Systemisk injektion av FK-bindande protein dimerizer, AP20187 (AP), inducerar apoptos av de celler som uttrycker transgenen. Uttrycket av EGFP ger oss också möjlighet att övervaka makrofager i DRG. Att tömma makrofager i maffian möss, började vi våra studier med 3 dagliga intraperitoneala injektioner av AP (1 mg/kg). Efter den sista injektionen var DRG sektionerad för immunofärgning för GFP. Vi noterade en signifikant förlust av GFP+ -celler i DRG hos de AP-behandlade möss jämfört med Veh-behandlade möss (figur 1a-B). I ett separat experiment använde vi detta protokoll för att mekaniskt separera DRG-makrofages efter behandlingen. Efterföljande FACS analys avslöjade en lyckad utarmning av GFPHi population i AP-behandlade möss (figur 1C-D) och visade den höga kvaliteten på isolerade celler.
Vi karakteriserade också de isolerade DRG-cellerna från Wild-typ möss. Mekaniskt isolerade DRG-celler (L4/L5) färgas med α-Mouse CX3CR1-APC-antikropp. Vi fann att 6% av DRG-cellerna var CX3CR1+ makrofager (figur 2a-B). Cellernas lönsamhet bedömdes också med Propidium jodid (slutlig koncentration på 2,5 μg/ml) som binder till det intracellulära DNA i de icke-livskraftiga cellerna, vilket avslöjar att mer än 80% av de nyligen isolerade DRG-cellerna var livskraftiga (figur 2C-D).
Figur 1: FACS analys av makrofager i DRG av maffian möss efter AP behandling.
MAFIA MICE fick daglig intraperitoneal injektion av 1 mg/kg AP20187 (AP) eller vehikel (VEH) i 3 dagar före analysen. (a, B) Representativa immuninfärgning bilder som visar AP-inducerad utarmning av GFP+ (grön) makrofager i L4/L5 DRG efter 3RD AP-behandling. NF200 (blå) användes för att märka myeliniserade neuroner. Skalbar: 50 μm. (C, D) Den procentuella CSF1R-GFPHi celler efter mekanisk dissociation av L4/5 DRG bestämdes av FACS analys, och en representativ datauppsättning från tre oberoende experiment visas med andelen gated cellpopulation anges. Resultatet visar att 4% av de totala isolerade cellerna från DRG av VEH-behandlade djur var GFPHi macrophages. Däremot var endast 0,4% av de totala DRG celler GFPHi makrofager i AP-behandlade mus. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: FACS karakterisering av makrofager i DRG av Wild-typ möss.
(a, B) Ipsilaterala L4 och L5 DRG av naiva Wild-typ mus poolades för mekanisk dissociation. Procent CX3CR1+ makrofager mättes med FACS-analys (a). Gating för CX3CR1+ celler baserades på bakgrundfluorescensen i de celler som inkuberades med APC-konjugerad isotyp kontroll antikropp (B). (C, D) Cellviabiliteten hos nyligen isolerade DRG-celler bedömdes med Propidium jodid (PI) färgning. PI+ -celler (C) var baserade på bakgrundfluorescensen i de obefläckade cellerna (D). En representativ datauppsättning från tre oberoende experiment visas med procentandelen av den gated cellpopulation som anges. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här introducerar vi en ny metod för att effektivt berika isolerade makrofager från Mouse DRG. Den konventionella metoden för att isolera DRG immunceller kräver enzymatisk nedbrytning15,18, som nu ersätts med mekanisk homogenisering i vårt protokoll för att begränsa oönskade cellskador och öka avkastningen. Därför är det nya protokollet mycket mindre tidskrävande. Ännu viktigare, enzym nedbrytning kan stimulera makrofager och ändra den molekylära signaturen. I motsats, vår mekaniska tillvägagångssätt kraftigt begränsar cellulära stress.
Med FACS analys, vi ytterligare kännetecknade makrofager i isolerade DRG celler och visade en stor cellulära återhämtning. Mer än 80% av isolerade DRG-celler enligt detta protokoll befanns vara livskraftiga (figur 2D). Minst 50 000 till 100 000 celler förväntas från L4/L5 DRG av en mus. Därför kan vi med tillförsikt dra slutsatsen att DRG-cellerna kan sorteras vidare i makrofagsubpopulationer14 för antingen kultur eller RNA-isolering. Det finns dock några kritiska steg som kan påverka avkastningen. Om den otillfredsställande cell avkastningen noteras, bör otillräcklig eller överdriven homogenisering i steg 2,1 misstänkas. Omfattningen av celldöd bedömas med PI (figur 2) eller 7-AAD färgning kan utnyttjas för att optimera protokollet. Dessutom kan DRG dissektion i steg 1,4 kräva upprepad övning för nybörjare.
För närvarande använder vårt labb i huvudsak detta protokoll för att studera DRG makrofager. Sannolikt kan tillämpningen av detta protokoll utökas för att studera andra icke-neuronala celler i DRG, såsom satellit celler19, och T-celler20. Ytterligare studier behövs för att bekräfta effektiviteten av cell isolering. Tyvärr, vår nuvarande mekaniska dissociation metod är inte idealisk för isolering av DRG sensoriska nervceller, och enzymatisk nedbrytning är fortfarande den mest effektiva metoden för sensoriska neuron isolering15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen relaterade till detta manuskript.
Acknowledgments
Studien stöddes av: Stiftelsen för anestesi utbildning och forskning (XY); UCSF Institutionen för anestesi och perioperativ vård (XY); och 1R01NS100801-01 (GZ). Denna studie stöddes delvis av HDFCCC laboratorium för cell analys gemensamma resurser Facility genom ett bidrag från NIH (P30CA082103).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| α-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
References
- Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354 (6312), 572-577 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neurosciences. 19 (3), 138-152 (2018).
- Hu, P., McLachlan, E. M. Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat. Experimental Neurology. 184 (2), 590-605 (2003).
- Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma. Nature Communication. 8 (1), 1778 (2017).
- Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling. Cell Reports. 22 (5), 1301-1312 (2018).
- Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy. The Journal of Pain. 17 (7), 775-786 (2016).
- Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury. Pain. 86 (1-2), 25-32 (2000).
- Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury. Nature Communication. 7, 12029 (2016).
- Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia. Pain. 130 (3), 225-234 (2007).
- Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury. Pain. 158 (9), 1666-1677 (2017).
- Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia. Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).
- Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. Journal of Neuroscience. 35 (48), 15934-15947 (2015).
- Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury. Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).
- Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 112 (49), E6808-E6817 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release. Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).
- Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene. J Leukoc Biol. 75 (4), 612-623 (2004).
- Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury. Science Reports. 7 (1), 16460 (2017).
- Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase. Nature Medicine. 21 (5), 518-523 (2015).
