細胞外小胞由来免疫細胞由来の特徴と細胞環境への機能的影響の研究
Summary
本報告書は、ミクログリアまたは血液マクロファージからの細胞外小胞(EV)単離に関する時系列的要件を強調している。ミクログリア由来EVは神経突起の伸長因子として評価され、血液マクロファージ由来EVはインビトロアッセイにおけるC6グリオーマ細胞浸潤の制御で研究された。目標は、これらのEV機能を特定の微小環境における免疫メディエーターとして理解することです。
Abstract
中枢神経系(CNS)の神経炎症状態は、生理学的および病理学的状態において重要な役割を果たす。ミクログリアは、脳内に存在する免疫細胞、および時には浸潤した骨髄由来マクロファージ(Bmdm)を、CNSにおけるそれらの微小環境の炎症プロファイルを調節する。免疫細胞からの細胞外小胞(EV)集団が免疫メディエーターとして機能することが受け入れられています。したがって、その収集と分離は、その内容を特定するだけでなく、レシピエント細胞に対する生物学的影響を評価するために重要である。本データは、超遠心分離およびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)ステップを含む、ミクログリア細胞または血液マクロファージからのEV分離に関する時系列的要件を強調している。非標的プロテオミクス解析により、EVマーカーとしてのタンパク質シグネチャの検証が可能になり、生物学的に活性なEVコンテンツが特徴付けされました。ミクログリア由来のEVは、神経突起の成長における免疫メディエーターとしての重要性を評価するために、ニューロンの一次培養にも機能的に使用された。その結果、ミクログリア由来のEVが、インビトロでの神経突起の成長を促進する作用を示した。並行して、血液マクロファージ由来のEVは、C6グリオーマ細胞のスフェロイド培養において免疫メディエーターとして機能的に使用され、これらのEVがインビトロでグリオーマ細胞の浸潤を制御することを示す結果である。このレポートでは、EV媒介免疫細胞機能を評価する可能性を強調する一方で、そのような通信の分子基盤を理解する。この解読は、CNS病理の微小環境における免疫特性を模倣するために、自然小胞および/または治療小胞のインビトロ調製を促進することができる。
Introduction
多くの神経病理学は、ますます考慮されている複雑なメカニズムである神経炎症状態に関連していますが、免疫プロセスは多様であり、細胞環境に依存しているため、まだ十分に理解されていません。実際、CNS障害は体系的に同じ活性化シグナルおよび免疫細胞集団を含まないため、炎症促進反応または抗炎症反応は病理学の原因または結果として評価することは困難である。「ミクログリア」と呼ばれる脳内マクロファージは、神経系と免疫系の間の界面にあるように見える。ミクログリアは骨髄由来を有し、脳を植民地化する原始造形中の黄身嚢に由来するが、末梢マクロファージは末梢マクロファージ2となる決定的な造形中の胎児肝臓に由来する。ミクログリア細胞は、アストロサイトやオリゴデンドロサイト3などのニューロンおよびニューロン由来のグリア細胞と通信する。最近のいくつかの研究では、ミクログリアがCNSの発達および成人組織恒常性の間に神経可塑性に関与していること、また神経変性疾患44,55に関連する炎症性状態で関与することが示されている。さもなければ、血液脳関門の完全性は、他のCNS病理において損なわれる可能性がある。免疫応答は、特に多形性神経膠芽腫において、血管形成過程およびリンパ管の存在を介して血液脳関門が再編成される6、77のミクログリア細胞のみでは支持されない。したがって、大骨髄由来マクロファージ(BMDM)浸潤は、腫瘍依存性血管新生機構全体にわたって脳腫瘍に起こる8。癌細胞は、免疫抑制性および腫瘍増殖につながる浸潤性BMに大きな影響を及ぼす9.このように免疫細胞とそれらの脳微小環境との間の通信は、細胞起源及び活性化シグナルが多様である10,11,11として理解し難い。このように、生理学的条件下で免疫細胞関連の分子シグネチャの機能を理解することは興味深い。この点に関して、細胞外小胞(EV)の放出を通して、免疫細胞と細胞微小環境との間の細胞間のコミュニケーションを研究することができる。
EVは、健康での免疫機能の調節、および病理学的状態12,13,13においてますます研究されている。エキソソームとミクロシクルの2つの集団を考慮することができる。それらは異なった生物発生およびサイズ範囲を提示する。エキソソームは、直径30~150nmの小胞で、内膜系から生成され、多面体(MVB)と血漿膜との融合時に分泌される。マイクロベシクルは直径約100〜1,000nmで、細胞形質膜14から外へ出芽することによって生成される。エキソソームとミクロベシクルの差別は、サイズや分子パターンに応じて実現することは困難であるため、本レポートではEVという用語のみを使用します。CNSにおけるEV関連通信は、線虫、昆虫またはアンネリド15、16を含む無脊椎動物種への関与を示した研究以来、16祖先のメカニズムを表す。さらに、EVが異種の細胞と通信できることを示す結果は、このメカニズムがキーロックシステムであることを示し、まず小胞とレシピエント細胞間の表面分子認識に基づいて、メディエーター16、17,17の取り込みを可能にする。実際、EVは、タンパク質(例えば、酵素、シグナル伝達、生物新生因子)、脂質(例えば、セラミド、コレステロール)または核酸(例えば、DNA、mRNAまたはmiRNA)がレシピエント細胞活動の直接的または間接的な調節因子として作用するタンパク質のような多くの分子を含んでいる。そのため、免疫細胞に対しても方法論的研究が行われ、EVを単離し、タンパク質シグネチャ18,19,19を完全に特徴付けた。
最も初期の研究では、Wnt3a-またはセロトニン依存活性化20,21,21に続く誘導機構として、一次培養ラットミクログリアからのエキソソームの放出を実証した。CNSにおいて機能的には、ミクログリア由来のEVは、神経興奮性22,23,23の制御に寄与するニューロンにおけるシナプス前末端によるシナプスベシクル放出を調節する。ミクログリア由来のEVは、大きな脳領域24,25,25においてサイトカイン媒介性炎症反応を伝播することもできる。重要なことに、トール様受容体ファミリーのための多様なリガンドは、ミクログリア26のEVの特定の生産を活性化するかもしれない。例えば、インビトロ研究は、LPS活性化ミクログリアBV2細胞株が炎症促進サイトカイン27を含む微分EV内容物を産生することを示している。したがって、CNSにおける免疫細胞亜集団の機能的多様性、ミクログリアおよび浸潤BMDMは、レシピエント細胞へのEVの影響およびEV内容物の同定を含む独自のEV集団を通じて評価され得る。
我々は、マイクログリアおよびBMDM由来EVの機能特性を、16,19,19の分離後に評価する方法を説明した。本報告では、ミクログリア由来EVが神経突起の伸長に及ぼす影響と、グリオーマ細胞凝集体の制御に及ぼすマクロファージ由来EVの効果を独自に評価することを提案する。また、EV単離手順を検証し、生物学的に活性なタンパク質シグネチャを同定するために、EV画分の広いプロテオミクス解析を提案する。EV内容物の有益な効果と分子解読は、脳障害における治療剤としての可能な操作および使用に役立つ可能性がある。
Protocol
Representative Results
Discussion
中枢神経系(CNS)は、細胞間通信がホメオスタシス30に必要な正常な神経機能を調節する複雑な組織である。EVは現在広く研究され、細胞間通信31のための重要な分子貨物として記述されている。彼らは特にレシピエント細胞にメディエーターのカクテルを提供し、それによって健康で病的な状態におけるそれらの機能に影響を与える32.最近?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
発表された作品は、ミニステール・ド・ラ・エデュケーション・ナショナル、ド・ランセニュエ・シュペリエール・エ・ド・ラ・レシェルシュ、インサームによって支えられました。私たちは、BICeL – キャンパスサイエンティフィックシティ施設が楽器や技術アドバイスにアクセスすることを感謝しています。ジャン=パスカル・ギメノ、スライマン・アブールアール、イザベル・フルニエの質量分析支援を心よりお見せします。私たちは、タニナ・アラブ、クリステル・ファン・キャンプ、フランソワーズ・ル・マレック・クロク、ヤコポ・ヴィツィオーリ、ピエール=エリック・ソティエールが科学技術開発に強く貢献してくれたことを感謝しています。
Materials
| 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-rad | 4561045EDU | |
| Acetonitrile | Fisher Chemicals | A955-1 | |
| Amicon 50 kDa centrifugal filter | Merck | UFC505024 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659) | Santa-cruz | sc-13119 | |
| B27 Plus supplement | Gibco | A3582801 | |
| BenchMixer V2 Vortex Mixer | Benchmark Scientific | BV1003 | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford) | Bio-Rad | 5000006 | |
| C18 ZipTips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| C6 rat glioma cell | ATCC | ATCC CCL-107 | |
| Canonical tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804000010 | |
| CO2 Incubator | ThermoFisher | ||
| Confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | LSM880 | |
| Cover glass | Marienfeld | 111580 | |
| Culture Dish (60 mm) | Sarstedt | 82.1473 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph | ThermoFisher | ||
| Electron microscope JEM-2100 | JEOL | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03777-10G | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
| Exo-FBS | Ozyme | EXO-FBS-50A-1 | Exosome depleted FBS |
| ExoCarta database (top 100 proteins of Evs) | http://www.exocarta.org/ | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140071 | |
| Fetal Horse Serum | Biowest | S0960-500 | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe | Fisherbrand | 12893543 | |
| FlexAnalysis | Brucker | ||
| Fluorescence mounting medium | Agilent | S3023 | |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 695076 | |
| Formvar-carbon coated copper grids | Agar scientific Ltd | AGS162-3 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Hoechst 33342 | Euromedex | 17535-AAT | |
| Idoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| InstantBlue Coomassie Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
| Invert light microscope CKX53 | Olympus | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| LabTek II 8 wells | Nunc | 154534 | |
| Laemmli 2X | Bio-Rad | 1610737 | |
| Laminin | Corning | 354232 | |
| MaxQuant software (proteins identification software) | https://maxquant.net/maxquant/ | ||
| MBT Polish stell | Brucker | 8268711 | |
| MEM 10X | Gibco | 21090-022 | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M6385-100G | |
| MiliQ water | Merck Millipore | ||
| Milk | Regilait | REGILAIT300 | |
| Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | |
| MonoP FPLC column | GE Healthcare | no longer available | |
| Nanosight NS300 | Malvern Panalytical | NS300 | |
| NanoSight NTA software v3.2 | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight syringe pump | Malvern Panalytical | ||
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Nitrocellulose membrane | GE Healthcare | 10600007 | |
| Nonidet P-40 | Fluka | 56741 | |
| Nunc multidish 24 wells | ThermoFisher | 82.1473 | |
| Paraformaldehyde | Electro microscopy Science | 15713 | |
| PC-12 cell line | ATCC | ATCC CRL-1721 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Peptide calibration mix | LaserBio Labs | C101 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
| Perseus software (Processing of identified proteins) | https://maxquant.net/perseus/ | ||
| Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate | Santa-cruz | sc-362065 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 14190094 | no calcium, no magnesium |
| pluriStrainer M/ 60 µm | pluriSelect | 43-50060 | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | 355651 | |
| Protease Inhibitor | Sigma-Aldrich | S8830-20TAB | |
| PureCol | Cell Systems | 5005 | |
| Q-Exactive mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| rapifleX mass spectrometer | Brucker | ||
| Rat cortical neurons | Cell Applications | R882N-20 | Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains |
| Rat Macrophage & Microglia Culture Medium | Cell Applications | R620K-100 | Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow |
| Rat primary macrophages | Cell Applications | R8818-10a | |
| Rat primary microglia | Lonza | RG535 | |
| Sepharose CL-2B | GE Healthcare | 17014001 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Slide | Dustsher | 100204 | |
| Sodium Chloride | Scharlau | SO0227 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | S7920-100G | |
| Sodium hydroxide | Scharlab | SO0420005P | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | S6422-100G | |
| SpeedVac Vacuum Concentrator | ThermoFisher | ||
| String software (functional protein association networks) | https://string-db.org/ | ||
| SuperSignal West Dura extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | |
| Syringe 1.0 mL | Terumo | 8SS01H1 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Tris | Interchim | UP031657 | |
| Tris-Glycine | Euromedex | EU0550 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95765 | |
| Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti | Beckman Coulter | 342184 | |
| Uranyl acetate | Agar Scientific Ltd | AGR1260A | |
| Whatman filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10347510 | |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | C2020-25G |
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