Характеристика экстраклеточных пузырьков, полученных из иммунных клеток, и изучение функционального воздействия на клеточную среду
Summary
В настоящем докладе освещаются хронологические требования к внеклеточной изоляции везикулы (EV) от микроглии или макрофагов крови. Микроглии полученных EVs были оценены как регуляторы неврит нарастания в то время как кровь макрофаг полученных EVs были изучены в контроле C6 глиомы ячейки вторжения в пробирке анализов. Цель состоит в том, чтобы лучше понять эти функции EV в качестве иммунных посредников в конкретных микросредах.
Abstract
Нейровоспалительное состояние центральной нервной системы (ЦНС) играет ключевую роль в физиологических и патологических состояниях. Микроглия, резидентиммунные клетки в головном мозге, а иногда и проникновение макрофагов из костного мозга (BMDMs), регулируют воспалительный профиль их микроокружения в ЦНС. В настоящее время принято, что внеклеточные везикулы (EV) популяций из иммунных клеток выступают в качестве иммунных посредников. Таким образом, их сбор и изоляция имеют важное значение для определения их содержания, но и для оценки их биологического воздействия на клетки-реципиента. В настоящее время данные подчеркивают хронологические требования к изоляции EV от клеток микроглии или макрофагов крови, включая ультрацентрифугацию и хроматографию размеров (SEC). Нецелевой протеомный анализ позволил валидации белковых подписей в качестве маркеров EV и охарактеризовал биологически активное содержание EV. Микроглии полученных EVs были также функционально использованы на первичной культуре нейронов, чтобы оценить их важность в качестве иммунных посредников в неврит роста. Результаты показали, что микроглии полученных EVs способствовать облегчению неврита рост в пробирке. Параллельно, кровь макрофагов полученных EVs были функционально использованы в качестве иммунных посредников в сфероидных культур клеток глиомы C6, результаты, показывающие, что эти ЭВ контролировать вторжение глиомы клеток в пробирке. В настоящем докладе подчеркивается возможность оценки функций иммунных клеток, опосредованных ЕВ, а также понимания молекулярных основ такой связи. Это расшифровка может способствовать использованию природных пузырьков и/или экстракорпорного приготовления терапевтических пузырьков для имитации иммунных свойств в микроокружении патологий ЦНС.
Introduction
Многие нейропатологии связаны с нейровоспалительным состоянием, которое является сложным механизмом, который все чаще рассматривается, но все еще плохо понимается, потому что иммунные процессы разнообразны и зависят от клеточной среды. Действительно, расстройства ЦНС систематически не связаны с теми же сигналами активации и популяциями иммунных клеток, и, таким образом, про- или противовоспалительные реакции трудно оценить как причины или последствия патологий. Мозг резидентов макрофаги называется “микроглии”, как представляется, на стыке нервной и иммуннойсистемы 1. Микроглия имеют миелоидное происхождение и являются производными от желток мешок во время примитивных hematopoiesis колонизировать мозг, в то время как периферийные макрофаги являются производными от печени плода во время окончательного hematopoiesis стать периферийных макрофагов2. Клетки микроглии общаются с нейронами и нейронами, полученными глиальными клетками, такими как астроциты и олигодендроциты3. Несколько недавних исследований показали, что микроглии участвуют в нейронной пластичности во время развития ЦНС и взрослых тканей гомеостаза, а также в воспалительном состоянии, связанном с нейродегенеративными заболеваниями4,5. В противном случае, целостность гематоэнцефалического барьера может быть нарушена в других патологиях ЦНС. Иммунные реакции, особенно при мультиформе рака глиобластомы, не поддерживаются только клетками микроглии, так как гематоэнцефалический барьер реорганизуется через ангиогенные процессы и наличие лимфатических сосудов6,,7. Таким образом, большой костного мозга полученных макрофагов (BMDMs) инфильтрация происходит в опухоли головного мозга через опухолевых механизмов ангиогенеза8. Раковые клетки оказывают значительное влияние на проникнутые БМДМ, что приводит к иммуносупрессивным свойствам и росту опухоли9. Таким образом, связь между иммунными клетками и их микроокружения мозга трудно понять, как происхождение клеток и активации сигналы разнообразны10,11. Таким образом, интересно задержать функции иммунных клеток, связанных молекулярных подписей в физиологических условиях. В связи с этим, клеточная связь между иммунными клетками и микроокружением клеток может быть изучена путем высвобождения внеклеточных пузырьков (ЭВ).
EVs изучаются все больше и больше в регуляции иммунных функций в здоровых, а также патологических условиях12,13. Можно принимать во внимание две популяции, экзосомы и микровезички. Они представляют различные биогенеза и диапазоны размеров. Экзосомы представляют собой пузырьки диаметром от 30 до 150 нм и генерируются из эндозомальной системы и выделяются при слиянии многопузырьковых тел (МВБ) с плазменной мембраной. Микровезики около 100-1000 нм в диаметре и генерируются внешним почками из мембраны плазмы клетки14. Поскольку экзосома против микровесикла дискриминации по-прежнему трудно реализовать в соответствии с размером и молекулярными моделями, мы будем использовать только термин EVs в настоящем докладе. EV-ассоциированных связи в ЦНС представляет собой механизм предков, поскольку исследования показали их участие в беспозвоночных видов, включая нематод, насекомых или аннелид15,16. Кроме того, результаты, показывающие, что EVs может общаться с клетками из разных видов, демонстрируют этот механизм, чтобы быть системой блокировки ключей, основанной сначала на распознавании поверхностных молекул между пузырьками и клетками-реципиентами, а затем позволяющим поглощению посредников16,17. Действительно, EVs содержат много молекул, как белки (например, ферменты, трансдукция сигнала, биогенез фактор), липиды (например, керамид, холестерин) или нуклеиновых кислот (например, ДНК, мРНК или miRNAs), действующих в качестве прямых или косвенных регуляторов деятельности клеток-реципиентов14. Именно поэтому были проведены методические исследования на иммунных клетках для изоляции ЭВ и полной характеристики их белковых подписей18,19.
Самые ранние исследования продемонстрировали высвобождение экзосом из первичной культивируемой крысиной микроглии в качестве индуцируемого механизма после wnt3a- или серотонина-зависимой активации20,21. Функционально в ЦНС, микроглии полученных EVs регулируют синаптический везикул релиз пресинаптических терминалов в нейронах, способствующих контролю возбудимости нейронов22,23. Микроглии полученных EVs может также размножаться цитокинов опосредошной воспалительной реакции в больших областях мозга24,25. Важно отметить, что разнообразные лиганды для платных рецепторов семьи может активировать конкретные производства EVs в микроглии26. Например, исследования in vitro показывают, что LPS-активированные микроглии BV2 клеточные линии производят дифференциальное содержание EV, включая провоспалительные цитокины27. Таким образом, функциональное разнообразие субпопуляций иммунных клеток в ЦНС, микроглии и проникновения BMDMs, могут быть оценены через свои собственные популяции EV, включая воздействие EV на клетки-реципиента и идентификации содержимого EV.
Ранее мы описали методы оценки функциональных свойств микроглии и БМДМ полученных EVs после их изоляции16,19. В настоящем докладе мы предлагаем самостоятельно оценить влияние микроглий полученных ЭВ на невритный рост, а также влияние эвакуированных макрофагов на контроль агрегатов клеток глиомы. Это исследование также предлагает широкий протеомный анализ фракций EV для того, чтобы проверить процедуру изоляции EV, а также определить биологически активные подписи белка. Благотворное воздействие и молекулярной расшифровки содержимого EV может помочь их возможные манипуляции и использования в качестве терапевтических агентов в расстройства мозга.
Protocol
Representative Results
Discussion
Центральная нервная система (ЦНС) представляет собой сложную ткань, в которой связь от клеток к клетке регулирует нормальные нейронные функции, необходимые для гомеостаза30. EVs в настоящее время широко изучены и описаны как важные молекулярные грузы для клеточной связи<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Представленная работа была поддержана Национальным министерством образования, де Л’Энсеньмент-Супьерии и ИНСЕРМ. Мы с благодарностью отмечаем BICeL- Кампус Научный городской фонд за доступ к инструментам и техническим консультациям. Мы с благодарностью признательны за помощь в масс-спектрометрии, в которой были с благодарностью юан-Паскаль Химено, Сулейман Абулуар и Изабель Фурнье. Мы с благодарностью признательны Танине Араб, Кристель ван Камп, Франсуазе ле Мартрек-Крок, Якопо Визиоли и Пьеру-Эрику Сотьеру за их значительный вклад в научно-технические разработки.
Materials
| 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-rad | 4561045EDU | |
| Acetonitrile | Fisher Chemicals | A955-1 | |
| Amicon 50 kDa centrifugal filter | Merck | UFC505024 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659) | Santa-cruz | sc-13119 | |
| B27 Plus supplement | Gibco | A3582801 | |
| BenchMixer V2 Vortex Mixer | Benchmark Scientific | BV1003 | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford) | Bio-Rad | 5000006 | |
| C18 ZipTips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| C6 rat glioma cell | ATCC | ATCC CCL-107 | |
| Canonical tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804000010 | |
| CO2 Incubator | ThermoFisher | ||
| Confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | LSM880 | |
| Cover glass | Marienfeld | 111580 | |
| Culture Dish (60 mm) | Sarstedt | 82.1473 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph | ThermoFisher | ||
| Electron microscope JEM-2100 | JEOL | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03777-10G | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
| Exo-FBS | Ozyme | EXO-FBS-50A-1 | Exosome depleted FBS |
| ExoCarta database (top 100 proteins of Evs) | http://www.exocarta.org/ | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140071 | |
| Fetal Horse Serum | Biowest | S0960-500 | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe | Fisherbrand | 12893543 | |
| FlexAnalysis | Brucker | ||
| Fluorescence mounting medium | Agilent | S3023 | |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 695076 | |
| Formvar-carbon coated copper grids | Agar scientific Ltd | AGS162-3 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Hoechst 33342 | Euromedex | 17535-AAT | |
| Idoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| InstantBlue Coomassie Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
| Invert light microscope CKX53 | Olympus | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| LabTek II 8 wells | Nunc | 154534 | |
| Laemmli 2X | Bio-Rad | 1610737 | |
| Laminin | Corning | 354232 | |
| MaxQuant software (proteins identification software) | https://maxquant.net/maxquant/ | ||
| MBT Polish stell | Brucker | 8268711 | |
| MEM 10X | Gibco | 21090-022 | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M6385-100G | |
| MiliQ water | Merck Millipore | ||
| Milk | Regilait | REGILAIT300 | |
| Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | |
| MonoP FPLC column | GE Healthcare | no longer available | |
| Nanosight NS300 | Malvern Panalytical | NS300 | |
| NanoSight NTA software v3.2 | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight syringe pump | Malvern Panalytical | ||
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Nitrocellulose membrane | GE Healthcare | 10600007 | |
| Nonidet P-40 | Fluka | 56741 | |
| Nunc multidish 24 wells | ThermoFisher | 82.1473 | |
| Paraformaldehyde | Electro microscopy Science | 15713 | |
| PC-12 cell line | ATCC | ATCC CRL-1721 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Peptide calibration mix | LaserBio Labs | C101 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
| Perseus software (Processing of identified proteins) | https://maxquant.net/perseus/ | ||
| Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate | Santa-cruz | sc-362065 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 14190094 | no calcium, no magnesium |
| pluriStrainer M/ 60 µm | pluriSelect | 43-50060 | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | 355651 | |
| Protease Inhibitor | Sigma-Aldrich | S8830-20TAB | |
| PureCol | Cell Systems | 5005 | |
| Q-Exactive mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| rapifleX mass spectrometer | Brucker | ||
| Rat cortical neurons | Cell Applications | R882N-20 | Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains |
| Rat Macrophage & Microglia Culture Medium | Cell Applications | R620K-100 | Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow |
| Rat primary macrophages | Cell Applications | R8818-10a | |
| Rat primary microglia | Lonza | RG535 | |
| Sepharose CL-2B | GE Healthcare | 17014001 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Slide | Dustsher | 100204 | |
| Sodium Chloride | Scharlau | SO0227 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | S7920-100G | |
| Sodium hydroxide | Scharlab | SO0420005P | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | S6422-100G | |
| SpeedVac Vacuum Concentrator | ThermoFisher | ||
| String software (functional protein association networks) | https://string-db.org/ | ||
| SuperSignal West Dura extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | |
| Syringe 1.0 mL | Terumo | 8SS01H1 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Tris | Interchim | UP031657 | |
| Tris-Glycine | Euromedex | EU0550 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95765 | |
| Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti | Beckman Coulter | 342184 | |
| Uranyl acetate | Agar Scientific Ltd | AGR1260A | |
| Whatman filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10347510 | |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | C2020-25G |
References
- Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Sankowski, R., Mader, S., Valdes-Ferrer, S. I. Systemic Inflammation and the Brain: Novel Roles of Genetic, Molecular, and Environmental Cues as Drivers of Neurodegeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
- Chakrabarty, S., Kabekkodu, S. P., Singh, R. P., Thangaraj, K., Singh, K. K., Satyamoorthy, K. Microglia in health and disease. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 43 (3), 25-29 (2015).
- Sankowski, R., Mader, S., Valdés-Ferrer, S. I. Systemic inflammation and the brain: novel roles of genetic, molecular, and environmental cues as drivers of neurodegeneration. Frontiers in cellular neuroscience. 9, 28 (2015).
- Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Domingues, P., et al. Tumor infiltrating immune cells in gliomas and meningiomas. Brain, Behavior, and Immunity. 53, 1-15 (2016).
- Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nature Neuroscience. 19 (1), 20-27 (2016).
- Thion, M. S., et al. Microbiome Influences Prenatal and Adult Microglia in a Sex-Specific Manner. Cell. 172 (3), 500-516 (2018).
- Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
- Rajendran, L., et al. Emerging Roles of Extracellular Vesicles in the Nervous System. The Journal of Neuroscience. 34 (46), 15482-15489 (2014).
- Gupta, A., Pulliam, L. Exosomes as mediators of neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 11 (1), 68 (2014).
- van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Budnik, V., Ruiz-cañada, C., Wendler, F. Extracellular vesicles round off communication in the nervous system. Nature Reviews Neurosciences. 17, 160-172 (2016).
- Raffo-Romero, A., et al. Medicinal Leech CNS as a Model for Exosome Studies in the Crosstalk between Microglia and Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 4124 (2018).
- Zhou, Y., et al. Exosomes Transfer Among Different Species Cells and Mediating miRNAs Delivery. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (12), 4267-4274 (2017).
- Arab, T., et al. Proteomic characterisation of leech microglia extracellular vesicles (EVs): comparison between differential ultracentrifugation and OptiprepTM density gradient isolation. Journal of extracellular vesicles. 8 (1), 1603048 (2019).
- Murgoci, A. -. N., et al. Brain-Cortex Microglia-Derived Exosomes: Nanoparticles for Glioma Therapy. ChemPhysChem. 19 (10), 1205-1214 (2018).
- Glebov, K., et al. Serotonin stimulates secretion of exosomes from microglia cells. Glia. 63 (4), 626-634 (2015).
- Hooper, C., et al. Wnt3a induces exosome secretion from primary cultured rat microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 144 (2012).
- Gabrielli, M., et al. Active endocannabinoids are secreted on extracellular membrane vesicles. EMBO reports. 16 (2), 213-220 (2015).
- Antonucci, F., et al. Microvesicles released from microglia stimulate synaptic activity via enhanced sphingolipid metabolism. The EMBO Journal. 31 (5), 1231-1240 (2012).
- Frühbeis, C., Fröhlich, D., Kuo, W. P., Krämer-Albers, E. -. M. Extracellular vesicles as mediators of neuron-glia communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 182 (2013).
- Prada, I., et al. Glia-to-neuron transfer of miRNAs via extracellular vesicles: a new mechanism underlying inflammation-induced synaptic alterations. Acta neuropathologica. 135 (4), 529-550 (2018).
- Takenouchi, T., et al. Extracellular ATP induces unconventional release of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from microglial cells. Immunology Letters. 167 (2), 116-124 (2015).
- Yang, Y., Boza-Serrano, A., Dunning, C. J. R., Clausen, B. H., Lambertsen, K. L., Deierborg, T. Inflammation leads to distinct populations of extracellular vesicles from microglia. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 168 (2018).
- Duhamel, M., et al. Paclitaxel Treatment and Proprotein Convertase 1/3 (PC1/3) Knockdown in Macrophages is a Promising Antiglioma Strategy as Revealed by Proteomics and Cytotoxicity Studies. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (6), 1126-1143 (2018).
- Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. Journal of Neuroscience Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
- Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
- Rashed, M. H., et al. Exosomes: From Garbage Bins to Promising Therapeutic Targets. Int. J. Mol. Sci. Int. J. Mol. Sci. 18 (18), (2017).
- Yuana, Y., Sturk, A., Nieuwland, R. Extracellular vesicles in physiological and pathological conditions. Blood Reviews. 27 (1), 31-39 (2013).
- Frohlich, D., et al. Multifaceted effects of oligodendroglial exosomes on neurons: impact on neuronal firing rate, signal transduction and gene regulation. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
- Krämer-Albers, E. -. M., et al. Oligodendrocytes secrete exosomes containing major myelin and stress-protective proteins: Trophic support for axons. Proteomics. Clinical applications. 1 (11), 1446-1461 (2007).
- Verderio, C., et al. Myeloid microvesicles are a marker and therapeutic target for neuroinflammation. Annals of Neurology. 72 (4), 610-624 (2012).
- Prada, I., Furlan, R., Matteoli, M., Verderio, C. Classical and Unconventional Pathways of Vesicular Release in Microglia. GLIA. 61, 1003-1017 (2013).
- Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. , (2017).
- Kennedy, B. C., et al. Tumor-Associated Macrophages in Glioma: Friend or Foe. Journal of Oncology. 2013, 1-11 (2013).
- Potolicchio, I., Carven, G. J., Xu, X., Stipp, C., Riese, R. J., Stern, L. J., Santambroggio, L. Proteomic Analysis of Microglia-Derived Exosomes: Metabolic Role of the Aminopeptidase CD13 in Neuropeptide Catabolism1. The Journal of Immunology. 175, 2237-2243 (2005).
- Turola, E., Furlan, R., Bianco, F., Matteoli, M., Verderio, C. Microglial microvesicle secretion and intercellular signaling. Frontiers in Physiology. 3, (2012).
- Cocucci, E., Meldolesi, J. Ectosomes and exosomes : shedding the confusion between extracellular vesicles. Trends in Cell Biology. 25 (6), 364-372 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- de Vrij, J., et al. Glioblastoma-derived extracellular vesicles modify the phenotype of monocytic cells. International Journal of Cancer. 137 (7), 1630-1642 (2015).
- van der Vos, K. E., et al. Directly visualized glioblastoma-derived extracellular vesicles transfer RNA to microglia/macrophages in the brain. Neuro-Oncology. 18 (1), 58-69 (2016).
