Caracterización de vesículas extracelulares derivadas de células inmunes y estudio del impacto funcional en el entorno celular
Summary
El presente informe destaca los requisitos cronológicos para el aislamiento de vesículas extracelulares (EV) de la microglia o de los macrófagos sanguíneos. Los vehículos eléctricos derivados de la microglia se evaluaron como reguladores del crecimiento de la neurita, mientras que los vehículos eléctricos derivados de macrófagos sanguíneos se estudiaron en el control de la invasión de células de glioma C6 en ensayos in vitro. El objetivo es comprender mejor estas funciones EV como mediadores inmunes en microambientes específicos.
Abstract
El estado neuroinflamatorio del sistema nervioso central (SNC) desempeña un papel clave en las condiciones fisiológicas y patológicas. La microglia, las células inmunitarias residentes en el cerebro, y a veces los macrófagos derivados de la médula ósea infiltrantes (BMDM), regulan el perfil inflamatorio de su microambiente en el SNC. Ahora se acepta que las poblaciones de vesícula extracelular (EV) de las células inmunitarias actúan como mediadores inmunes. Por lo tanto, su recolección y aislamiento son importantes para identificar su contenido, pero también evaluar sus efectos biológicos en las células receptoras. Los presentes datos destacan los requisitos cronológicos para el aislamiento EV de las células de microglia o de los macrófagos sanguíneos, incluidos los pasos de la ultracentrifugación y la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Un análisis proteómico no dirigido permitió la validación de firmas de proteínas como marcadores EV y caracterizó el contenido de EV biológicamente activo. Los vehículos eléctricos derivados de la microglia también se utilizaron funcionalmente en el cultivo primario de las neuronas para evaluar su importancia como mediadores inmunes en el crecimiento de la neurita. Los resultados mostraron que los vehículos eléctricos derivados de la microglia contribuyen a facilitar el crecimiento de la neurita in vitro. Paralelamente, los vehículos eléctricos derivados de macrófagos en sangre se utilizaron funcionalmente como mediadores inmunes en cultivos esferoides de células de glioma C6, los resultados que muestran que estos vehículos eléctricos controlan la invasión de células de glioma in vitro. Este informe destaca la posibilidad de evaluar las funciones de las células inmunitarias mediadas por EV, pero también comprender las bases moleculares de dicha comunicación. Este desciframiento podría promover el uso de vesículas naturales y/o la preparación in vitro de vesículas terapéuticas con el fin de imitar las propiedades inmunitarias en el microambiente de las patologías del SNC.
Introduction
Muchas neuropatologías están relacionadas con el estado neuroinflamatorio que es un mecanismo complejo que se considera cada vez más, pero todavía mal entendido porque los procesos inmunológicos son diversos y dependen del entorno celular. De hecho, los trastornos del SNC no implican sistemáticamente las mismas señales de activación y las poblaciones de células inmunitarias y, por lo tanto, las respuestas pro o antiinflamatorias son difíciles de evaluar como causas o consecuencias de las patologías. Los macrófagos residentes en el cerebro llamados “microglia” parecen estar en la interfaz entre los sistemas nervioso e inmune1. Las microglia tienen un origen mieloide y se derivan del saco de yema durante la hematopoyesis primitiva para colonizar el cerebro, mientras que los macrófagos periféricos se derivan del hígado fetal durante la hematopoyesis definitiva para convertirse en macrófagos periféricos2. Las células de microglia se comunican con las neuronas y las células gliales derivadas de las neuronas, como los astrocitos y los oligodendrocitos3. Varios estudios recientes han demostrado que la microglia está implicada en la plasticidad neuronal durante el desarrollo del SNC y la homeostasis de tejido adulto, y también en el estado inflamatorio asociado con enfermedades neurodegenerativas4,,5. De lo contrario, la integridad de la barrera hematoencefálica puede verse comprometida en otras patologías del SNC. Las respuestas inmunitarias, especialmente en el cáncer de glioblastoma multiforme, no son apoyadas sólo por células de microglia, ya que la barrera hematoencefálica se reorganiza a través de procesos angiogénicos y la presencia de vasos linfáticos6,,7. Por lo tanto, una infiltración grande de macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) ocurre en el tumor cerebral a través de los mecanismos de angiogénesis dependientes del tumor8. Las células cancerosas ejercen una influencia significativa en los DMO infiltrados que conducen a propiedades inmunosupresoras y crecimiento tumoral9. Por lo tanto, la comunicación entre las células inmunitarias y su microambiente cerebral es difícil de entender ya que el origen celular y las señales de activación son diversas10,,11. Por lo tanto, es interesante aprehender las funciones de las firmas moleculares asociadas a células inmunes en condiciones fisiológicas. En este sentido, la comunicación célula-célula entre las células inmunitarias y el microambiente celular se puede estudiar mediante la liberación de vesículas extracelulares (EV).
Los vehículos eléctricos se están estudiando cada vez más en la regulación de las funciones inmunitarias en condiciones sanas y patológicas12,,13. Se pueden tener en cuenta dos poblaciones, exosomas y microvesículas. Presentan diferentes rangos de biogénesis y tamaño. Los exosomas son vesículas de 30-150 nm de diámetro y se generan a partir del sistema endosomal y se secretan durante la fusión de cuerpos multivesiculares (MVB) con la membrana plasmática. Las microvesículas miden unos 100–1.000 nm de diámetro y son generadas por un árbol externo de la membrana plasmática celular14. Debido a que la discriminación de exosoma versus microvesículas todavía es difícil de realizar de acuerdo con el tamaño y los patrones moleculares, sólo utilizaremos el término EV en el presente informe. La comunicación asociada a los vehículos ves por el VEHÍCULO en el SNC representa un mecanismo ancestral ya que los estudios mostraron su participación en especies de invertebrados, incluidos nematodos, insectos o anélidos15,,16. Además, los resultados que muestran que los vehículos eléctricos pueden comunicarse con células de diferentes especies demuestran que este mecanismo es un sistema de bloqueo de teclas, basado primero en el reconocimiento de moléculas de superficie entre vesículas y células receptoras y luego permitiendo la absorción de mediadores16,,17. De hecho, los vehículos eléctricos contienen muchas moléculas como proteínas (por ejemplo, enzimas, transducción de señales, factor de biogénesis), lípidos (por ejemplo, ceramida, colesterol) o ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARNm o miRNAs) que actúan como reguladores directos o indirectos de las actividades celulares receptoras14. Es por eso que también se realizaron estudios metodológicos en células inmunitarias para aislar los vehículos eléctricos y caracterizar completamente sus firmas proteicas18,,19.
Los primeros estudios demostraron la liberación de exosomas de la microglia de rata cultivada primaria como un mecanismo inducible después de una activación dependiente de Wnt3a o serotonina20,21. Funcionalmente en el SNC, los vehículos eléctricos derivados de la microglia regulan la liberación de vesículas sinápticas por terminales presinápticos en las neuronas que contribuyen al control de la excitabilidad neuronal22,,23. Los vehículos eléctricos derivados de la microglia también podrían propagar la respuesta inflamatoria mediada por citoquinas en regiones cerebrales grandes24,,25. Es importante destacar que los diversos ligandos para la familia de receptores similares a peajes podrían activar producciones específicas de vehículos eléctricos en la microglia26. Por ejemplo, los estudios in vitro muestran que las líneas celulares BV2 de microglia activada por LPS producen contenidos diferenciales de EV, incluidas las citoquinas proinflamatorias27. Por lo tanto, la diversidad funcional de las subpoblaciones de células inmunitarias en el SNC, la microglia y la infiltración de DMO, podría evaluarse a través de sus propias poblaciones de EV, incluido el impacto EV en las células receptoras y la identificación del contenido de EV.
Anteriormente describimos métodos para evaluar las propiedades funcionales de los vehículos eléctricos derivados de microglia y BMDM después de su aislamiento16,19. En el presente informe, proponemos evaluar de forma independiente el efecto de los vehículos eléctricos derivados de la microglia en el crecimiento de la neurita, y el efecto de los vehículos eléctricos derivados de macrófagos en el control de los agregados celulares del glioma. Este estudio también propone un amplio análisis proteómico de las fracciones EV con el fin de validar el procedimiento de aislamiento EV, así como identificar las firmas de proteínas biológicamente activas. Los efectos beneficiosos y el descifrado molecular de los contenidos de EV podrían ayudar a su posible manipulación y uso como agentes terapéuticos en trastornos cerebrales.
Protocol
Representative Results
Discussion
El sistema nervioso central (SNC) es un tejido complejo en el que la comunicación de célula a célula regula las funciones neuronales normales necesarias para la homeostasis30. Los vehículos eléctricos ahora son ampliamente estudiados y descritos como cargas moleculares importantes para la comunicación de célula a célula31. Entregan específicamente un cóctel de mediadores a las células receptoras, afectando así a sus funciones en condiciones sanas y patológicas<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo presentado contó con el apoyo del Ministerio de Educación Nacional, de L’Enseignement Supérieur et de la Recherche e INSERM. Agradecemos al BICeL- Campus Scientific City Facility por el acceso a instrumentos y consejos técnicos. Agradecemos a Jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard e Isabelle Fournier por la asistencia de espectrometría de masas. Agradecemos a Tanina Arab, Christelle van Camp, Francoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli y Pierre-Eric Sautiére por su fuerte contribución a los avances científicos y técnicos.
Materials
| 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-rad | 4561045EDU | |
| Acetonitrile | Fisher Chemicals | A955-1 | |
| Amicon 50 kDa centrifugal filter | Merck | UFC505024 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659) | Santa-cruz | sc-13119 | |
| B27 Plus supplement | Gibco | A3582801 | |
| BenchMixer V2 Vortex Mixer | Benchmark Scientific | BV1003 | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford) | Bio-Rad | 5000006 | |
| C18 ZipTips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| C6 rat glioma cell | ATCC | ATCC CCL-107 | |
| Canonical tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804000010 | |
| CO2 Incubator | ThermoFisher | ||
| Confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | LSM880 | |
| Cover glass | Marienfeld | 111580 | |
| Culture Dish (60 mm) | Sarstedt | 82.1473 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph | ThermoFisher | ||
| Electron microscope JEM-2100 | JEOL | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03777-10G | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
| Exo-FBS | Ozyme | EXO-FBS-50A-1 | Exosome depleted FBS |
| ExoCarta database (top 100 proteins of Evs) | http://www.exocarta.org/ | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140071 | |
| Fetal Horse Serum | Biowest | S0960-500 | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe | Fisherbrand | 12893543 | |
| FlexAnalysis | Brucker | ||
| Fluorescence mounting medium | Agilent | S3023 | |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 695076 | |
| Formvar-carbon coated copper grids | Agar scientific Ltd | AGS162-3 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Hoechst 33342 | Euromedex | 17535-AAT | |
| Idoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| InstantBlue Coomassie Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
| Invert light microscope CKX53 | Olympus | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| LabTek II 8 wells | Nunc | 154534 | |
| Laemmli 2X | Bio-Rad | 1610737 | |
| Laminin | Corning | 354232 | |
| MaxQuant software (proteins identification software) | https://maxquant.net/maxquant/ | ||
| MBT Polish stell | Brucker | 8268711 | |
| MEM 10X | Gibco | 21090-022 | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M6385-100G | |
| MiliQ water | Merck Millipore | ||
| Milk | Regilait | REGILAIT300 | |
| Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | |
| MonoP FPLC column | GE Healthcare | no longer available | |
| Nanosight NS300 | Malvern Panalytical | NS300 | |
| NanoSight NTA software v3.2 | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight syringe pump | Malvern Panalytical | ||
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Nitrocellulose membrane | GE Healthcare | 10600007 | |
| Nonidet P-40 | Fluka | 56741 | |
| Nunc multidish 24 wells | ThermoFisher | 82.1473 | |
| Paraformaldehyde | Electro microscopy Science | 15713 | |
| PC-12 cell line | ATCC | ATCC CRL-1721 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Peptide calibration mix | LaserBio Labs | C101 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
| Perseus software (Processing of identified proteins) | https://maxquant.net/perseus/ | ||
| Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate | Santa-cruz | sc-362065 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 14190094 | no calcium, no magnesium |
| pluriStrainer M/ 60 µm | pluriSelect | 43-50060 | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | 355651 | |
| Protease Inhibitor | Sigma-Aldrich | S8830-20TAB | |
| PureCol | Cell Systems | 5005 | |
| Q-Exactive mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| rapifleX mass spectrometer | Brucker | ||
| Rat cortical neurons | Cell Applications | R882N-20 | Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains |
| Rat Macrophage & Microglia Culture Medium | Cell Applications | R620K-100 | Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow |
| Rat primary macrophages | Cell Applications | R8818-10a | |
| Rat primary microglia | Lonza | RG535 | |
| Sepharose CL-2B | GE Healthcare | 17014001 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Slide | Dustsher | 100204 | |
| Sodium Chloride | Scharlau | SO0227 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | S7920-100G | |
| Sodium hydroxide | Scharlab | SO0420005P | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | S6422-100G | |
| SpeedVac Vacuum Concentrator | ThermoFisher | ||
| String software (functional protein association networks) | https://string-db.org/ | ||
| SuperSignal West Dura extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | |
| Syringe 1.0 mL | Terumo | 8SS01H1 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Tris | Interchim | UP031657 | |
| Tris-Glycine | Euromedex | EU0550 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95765 | |
| Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti | Beckman Coulter | 342184 | |
| Uranyl acetate | Agar Scientific Ltd | AGR1260A | |
| Whatman filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10347510 | |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | C2020-25G |
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