Charakterisierung von immunzellulären Vesikeln und Untersuchung der funktionellen Auswirkungen auf die Zellumgebung
Summary
Der vorliegende Bericht hebt die chronologischen Anforderungen an die extrazelluläre Vesikel-Isolierung (EV) von Mikroglia oder Blutmakrophagen hervor. Mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge wurden als Regulatoren des Neuritenwachstums evaluiert, während von Blutmakrophagen abgeleitete Elektrofahrzeuge bei der Kontrolle der C6-Gliomzellinvasion in In-vitro-Assays untersucht wurden. Ziel ist es, diese EV-Funktionen als Immunvermittler in bestimmten Mikroumgebungen besser zu verstehen.
Abstract
Der neuroinflammatorische Zustand des Zentralnervensystems (ZNS) spielt bei physiologischen und pathologischen Erkrankungen eine Schlüsselrolle. Mikroglia, die ansässigen Immunzellen im Gehirn und manchmal die infiltrierenden Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDMs), regulieren das entzündungshemmende Profil ihrer Mikroumgebung im ZNS. Es wird nun akzeptiert, dass die extrazellulären Vesikelpopulationen (EV) aus Immunzellen als Immunmediatoren fungieren. Daher sind ihre Sammlung und Isolierung wichtig, um ihren Inhalt zu identifizieren, aber auch ihre biologischen Auswirkungen auf Empfängerzellen zu bewerten. Die vorliegenden Daten heben die chronologischen Anforderungen an die EV-Isolierung von Mikrogliazellen oder Blutmakrophagen hervor, einschließlich der Schritte zur Ultrazentrifugation und Größenausschlusschromatographie (SEC). Eine nicht zielgerichtete proteomische Analyse ermöglichte die Validierung von Proteinsignaturen als EV-Marker und charakterisierte den biologisch aktiven EV-Gehalt. Mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge wurden auch funktionell auf der Primärkultur von Neuronen verwendet, um ihre Bedeutung als Immunmediatoren im Neuritenwachstum zu bewerten. Die Ergebnisse zeigten, dass mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge dazu beitragen, das Neuritenwachstum in vitro zu erleichtern. Parallel dazu wurden von Blutmakrophagen abgeleitete Elektrofahrzeuge funktionell als Immunmediatoren in Sphäroidkulturen von C6-Gliomzellen eingesetzt, die Ergebnisse zeigten, dass diese EVs die Gliomzellinvasion in vitro kontrollieren. Dieser Bericht hebt die Möglichkeit hervor, die EV-vermittelten Immunzellfunktionen zu bewerten, aber auch die molekularen Grundlagen einer solchen Kommunikation zu verstehen. Diese Entschlüsselung könnte die Verwendung natürlicher Vesikel und/oder die In-vitro-Vorbereitung von therapeutischen Vesikeln fördern, um Immuneigenschaften in der Mikroumgebung von ZNS-Pathologien nachzuahmen.
Introduction
Viele Neuropathologien stehen im Zusammenhang mit dem neuro-inflammatorischen Zustand, der ein komplexer Mechanismus ist, der zunehmend in Betracht gezogen wird, aber immer noch schlecht verstanden wird, weil die Immunprozesse vielfältig sind und von der Zellumgebung abhängen. Tatsächlich beinhalten die ZNS-Erkrankungen nicht systematisch die gleichen Aktivierungssignale und Immunzellpopulationen, so dass die pro- oder entzündungshemmenden Reaktionen als Ursachen oder Folgen von Pathologien schwer zu bewerten sind. Die hirnresidenten Makrophagen, die als “Mikroglia” bezeichnet werden, scheinen an der Schnittstelle zwischen Nerven- und Immunsystem zu sein1. Mikroglia haben einen myeloischen Ursprung und werden aus dem Dottersack während der primitiven Hämatopoese abgeleitet, um das Gehirn zu kolonisieren, während periphere Makrophagen von der fetalen Leber während der definitiven Hämatopoese abgeleitet werden, um periphere Makrophagen zu werden2. Die Mikrogliazellen kommunizieren mit Neuronen und neuronabgeleiteten Gliazellen wie Astrozyten und Oligodendrozyten3. Mehrere neuere Studien haben gezeigt, dass Mikroglia an neuronaler Plastizität während der ZNS-Entwicklung und der Homöostase von Erwachsenengewebe beteiligt ist, und auch im entzündlichen Zustand, der mit neurodegenerativen Erkrankungen assoziiert ist4,5. Andernfalls kann die Integrität der Blut-Hirn-Schranke in anderen ZNS-Pathologien beeinträchtigt werden. Die Immunantworten, insbesondere bei Glioblastom-Multiforme-Krebs, werden nicht nur von Mikroglia-Zellen unterstützt, da die Blut-Hirn-Schranke durch angiogene Prozesse und das Vorhandensein von Lymphgefäßen6,7reorganisiert wird. Daher tritt eine große Knochenmark-abgeleitete Makrophagen (BMDMs) Infiltration im Hirntumor durch tumorabhängige Angiogenesemechanismen8auf. Die Krebszellen üben einen signifikanten Einfluss auf infiltrierte BMDMs aus, was zu immunsuppressiven Eigenschaften und Tumorwachstum9führt. So ist die Kommunikation zwischen den Immunzellen und ihrer Gehirnmikroumgebung schwer zu verstehen, da der Zellursprung und die Aktivierungssignale unterschiedlich sind10,11. Es ist daher interessant, die Funktionen immunzellassoziierter molekularer Signaturen unter physiologischen Bedingungen zu erfassen. In diesem Zusammenhang kann die Zell-Zell-Kommunikation zwischen Immunzellen und Zellmikroumgebung durch die Freisetzung von extrazellulären Vesikeln (EVs) untersucht werden.
Die Elektrofahrzeuge werden mehr und mehr in der Regulierung von Immunfunktionen unter gesunden sowie pathologischen Bedingungen untersucht12,13. Zwei Populationen, Exosomen und Mikrovesiken, können berücksichtigt werden. Sie präsentieren unterschiedliche Biogenese und Größenbereiche. Die Exosomen sind Vesikel von 30 bis 150 nm Durchmesser und werden aus dem endosomalen System erzeugt und bei der Fusion von multivesicularen Körpern (MVBs) mit der Plasmamembran abgesondert. Die Mikrovesiken haben einen Durchmesser von etwa 100–1.000 nm und werden durch einen nach außen gerichteten Aufblühen aus der Zellplasmamembran14erzeugt. Da die Exosome n.A.-Mikrovesik-Diskriminierung je nach Größe und molekularen Mustern immer noch schwer zu realisieren ist, werden wir im vorliegenden Bericht nur den Begriff Elektrofahrzeuge verwenden. Die EV-assoziierte Kommunikation im ZNS stellt einen Ahnenmechanismus dar, da Studien ihre Beteiligung an wirbellosen Arten wie Nematoden, Insekten oder Anneliden15,16zeigten. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, die zeigen, dass Elektrofahrzeuge mit Zellen verschiedener Arten kommunizieren können, diesen Mechanismus als Schlüsselschlosssystem, das zunächst auf der Oberflächenmolekülerkennung zwischen Vesikeln und Empfängerzellen basiert und dann die Aufnahme von Mediatoren16,17ermöglicht. Tatsächlich enthalten die Elektrofahrzeuge viele Moleküle wie Proteine (z. B. Enzyme, Signaltransduktion, Biogenesefaktor), Lipide (z. B. Ceramid, Cholesterin) oder Nukleinsäuren (z. B. DNA, mRNA oder miRNAs), die als direkte oder indirekte Regulatoren der Empfängerzellaktivitäten14wirken. Deshalb wurden auch methodische Studien an Immunzellen durchgeführt, um Elektrofahrzeuge zu isolieren und ihre Proteinsignaturen vollständig zu charakterisieren18,19.
Die frühesten Studien zeigten die Freisetzung von Exosomen aus primär kultivierter Rattenmikroglia als induzierbaren Mechanismus nach einer Wnt3a- oder Serotonin-abhängigen Aktivierung20,21. Funktionell im ZNS regulieren mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge die synaptische Vesikelfreisetzung durch präsynaptische Terminals in Neuronen, die zur Kontrolle der neuronalen Erregbarkeit beitragen22,23. Mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge könnten auch Zytokine-vermittelte Entzündungsreaktionen in großen Hirnregionen24,25vermehren. Wichtig ist, dass die verschiedenen Liganden für die gebührenähnliche Rezeptorfamilie bestimmte Produktionen von Elektrofahrzeugen in der Mikroglia26aktivieren könnten. Beispielsweise zeigen In-vitro-Studien, dass LPS-aktivierte Mikroglia BV2-Zelllinien differenzielle EV-Gehalte einschließlich pro-inflammatorische Zytokineproduzieren 27. Daher könnte die funktionelle Vielfalt von Immunzellsubpopulationen in den ZNS-, Mikroglia- und infiltrierenden BMDMs durch ihre eigenen EV-Populationen bewertet werden, einschließlich der Auswirkungen von Elektrofahrzeugen auf Empfängerzellen und der Identifizierung von EV-Inhalten.
Wir haben zuvor Methoden beschrieben, um die funktionellen Eigenschaften von Mikroglia- und BMDM-abgeleiteten Elektrofahrzeugen nach deren Isolierung zu bewerten16,19. Im vorliegenden Bericht schlagen wir vor, die Wirkung von mikroglia-abgeleiteten Elektrofahrzeugen auf das Neuritenwachstum und die Wirkung von makrophageabgeleiteten Elektrofahrzeugen auf die Kontrolle von Gliomzellaggregaten unabhängig zu bewerten. Diese Studie schlägt auch eine breit angelegte proteomische Analyse der EV-Fraktionen vor, um das EV-Isolationsverfahren zu validieren und die biologisch aktiven Proteinsignaturen zu identifizieren. Die wohltuende Wirkung und die molekulare Entschlüsselung von EEV-Inhalten könnten ihnen helfen, sie zu manipulieren und als therapeutische Mittel bei Hirnerkrankungen zu verwenden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das zentralnervöse System (ZNS) ist ein komplexes Gewebe, in dem die Zell-zu-Zell-Kommunikation normale neuronale Funktionen reguliert, die für die Homöostase30notwendig sind. Elektrofahrzeuge werden heute weithin untersucht und als wichtige molekulare Ladungen für die Zell-zu-Zell-Kommunikation beschrieben31. Sie liefern speziell einen Cocktail von Mediatoren an Empfängerzellen und beeinflussen so ihre Funktionen unter gesunden und pathologischen Bedingungen<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die vorgestellte Arbeit wurde von der Ministére de L’Education Nationale, de L’Enseignement Supérieur et de la Recherche und INSERM unterstützt. Wir danken der BICeL- Campus Scientific City Facility für den Zugang zu Instrumenten und technischen Ratschlägen. Wir danken Jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard und Isabelle Fournier für die Unterstützung der Massenspektrometrie. Wir danken Tanina Arab, Christelle van Camp, Francoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli und Pierre-Eric Sautiére für ihren starken Beitrag zu den wissenschaftlichen und technischen Entwicklungen.
Materials
| 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-rad | 4561045EDU | |
| Acetonitrile | Fisher Chemicals | A955-1 | |
| Amicon 50 kDa centrifugal filter | Merck | UFC505024 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659) | Santa-cruz | sc-13119 | |
| B27 Plus supplement | Gibco | A3582801 | |
| BenchMixer V2 Vortex Mixer | Benchmark Scientific | BV1003 | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford) | Bio-Rad | 5000006 | |
| C18 ZipTips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| C6 rat glioma cell | ATCC | ATCC CCL-107 | |
| Canonical tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804000010 | |
| CO2 Incubator | ThermoFisher | ||
| Confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | LSM880 | |
| Cover glass | Marienfeld | 111580 | |
| Culture Dish (60 mm) | Sarstedt | 82.1473 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph | ThermoFisher | ||
| Electron microscope JEM-2100 | JEOL | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03777-10G | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
| Exo-FBS | Ozyme | EXO-FBS-50A-1 | Exosome depleted FBS |
| ExoCarta database (top 100 proteins of Evs) | http://www.exocarta.org/ | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140071 | |
| Fetal Horse Serum | Biowest | S0960-500 | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe | Fisherbrand | 12893543 | |
| FlexAnalysis | Brucker | ||
| Fluorescence mounting medium | Agilent | S3023 | |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 695076 | |
| Formvar-carbon coated copper grids | Agar scientific Ltd | AGS162-3 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Hoechst 33342 | Euromedex | 17535-AAT | |
| Idoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| InstantBlue Coomassie Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
| Invert light microscope CKX53 | Olympus | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| LabTek II 8 wells | Nunc | 154534 | |
| Laemmli 2X | Bio-Rad | 1610737 | |
| Laminin | Corning | 354232 | |
| MaxQuant software (proteins identification software) | https://maxquant.net/maxquant/ | ||
| MBT Polish stell | Brucker | 8268711 | |
| MEM 10X | Gibco | 21090-022 | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M6385-100G | |
| MiliQ water | Merck Millipore | ||
| Milk | Regilait | REGILAIT300 | |
| Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | |
| MonoP FPLC column | GE Healthcare | no longer available | |
| Nanosight NS300 | Malvern Panalytical | NS300 | |
| NanoSight NTA software v3.2 | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight syringe pump | Malvern Panalytical | ||
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Nitrocellulose membrane | GE Healthcare | 10600007 | |
| Nonidet P-40 | Fluka | 56741 | |
| Nunc multidish 24 wells | ThermoFisher | 82.1473 | |
| Paraformaldehyde | Electro microscopy Science | 15713 | |
| PC-12 cell line | ATCC | ATCC CRL-1721 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Peptide calibration mix | LaserBio Labs | C101 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
| Perseus software (Processing of identified proteins) | https://maxquant.net/perseus/ | ||
| Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate | Santa-cruz | sc-362065 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 14190094 | no calcium, no magnesium |
| pluriStrainer M/ 60 µm | pluriSelect | 43-50060 | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | 355651 | |
| Protease Inhibitor | Sigma-Aldrich | S8830-20TAB | |
| PureCol | Cell Systems | 5005 | |
| Q-Exactive mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| rapifleX mass spectrometer | Brucker | ||
| Rat cortical neurons | Cell Applications | R882N-20 | Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains |
| Rat Macrophage & Microglia Culture Medium | Cell Applications | R620K-100 | Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow |
| Rat primary macrophages | Cell Applications | R8818-10a | |
| Rat primary microglia | Lonza | RG535 | |
| Sepharose CL-2B | GE Healthcare | 17014001 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Slide | Dustsher | 100204 | |
| Sodium Chloride | Scharlau | SO0227 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | S7920-100G | |
| Sodium hydroxide | Scharlab | SO0420005P | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | S6422-100G | |
| SpeedVac Vacuum Concentrator | ThermoFisher | ||
| String software (functional protein association networks) | https://string-db.org/ | ||
| SuperSignal West Dura extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | |
| Syringe 1.0 mL | Terumo | 8SS01H1 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Tris | Interchim | UP031657 | |
| Tris-Glycine | Euromedex | EU0550 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95765 | |
| Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti | Beckman Coulter | 342184 | |
| Uranyl acetate | Agar Scientific Ltd | AGR1260A | |
| Whatman filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10347510 | |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | C2020-25G |
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