Summary
Dette manuskriptet beskriver en isfri kryonisk bevaring metode for store mengder rotte hepatocytter der primære celler er pre-inkubert med cryoprotective agenter på en lav konsentrasjon og vitrified i store dråper.
Abstract
Vitrifikasjon er et lovende isfritt alternativ for klassisk langsom frysing (ved ca. 1 ° c/min) kryonisk bevaring av biologiske prøver. Vitrifikasjon krever ekstremt raske kjølehastigheter for å oppnå overgangen av vann inn i glass fasen og samtidig unngå skadelig isdannelse. Selv om pre-inkubasjons med cryoprotective agenter (CPA) kan redusere den kritiske kjøle hastigheten av biologiske prøver, høye konsentrasjoner er vanligvis nødvendig for å aktivere isfri kryonisk bevaring ved vitrifikasjon. Som et resultat, vitrifikasjon er hemmet av CPA toksisitet og begrenset til små prøver som kan kjøles raskt. Det ble nylig demonstrert at disse iboende begrensningene kan overvinnes ved bulk dråpe vitrifikasjon. Ved hjelp av denne romanen metoden, celler er første pre-inkubert med en lav intracellulære CPA konsentrasjon. Ved å utnytte hurtig osmotisk dehydrering, er intracellulære-CPA konsentrert rett foran vitrifikasjon, uten å måtte fullt likevekt giftige CPA-konsentrasjoner. Den cellulære dehydrering er utført i en fluidic enhet og integrert med kontinuerlig høy gjennomstrømning generasjon av store størrelser dråper som er vitrified i flytende nitrogen. Denne isen-fri kryonisk bevaring metoden med minimal CPA toksisitet er egnet for store celle mengder og resulterer i økt hepatocytter levedyktighet og metabolsk funksjon i forhold til klassisk langsom frysing kryonisk bevaring. Dette manuskriptet beskriver metodene for vellykket bulk dråpe vitrifikasjon i detalj.
Introduction
Tap av celle levedyktighet og metabolsk funksjon etter kryonisk bevaring av hepatocytter er fortsatt et stort problem som begrenser kliniske anvendelser1,2,3. Den benchmark metoden for hepatocytter kryonisk bevaring er langsom frysing, som er utført av pre-incubating hepatocytter med CPA (dimethyl sulfoxide [DMSO], glukose, og albumin) og påfølgende kontrollert hastighet frysing (ved ca 1 ° c/min) til kryogene temperaturer4,5. Til tross for mange rapporterte optimaliseringer, CPA toksisitet sammen med skadelig osmotisk ubalanser under frysing og mekanisk stress av isen formasjon fortsatt grunnleggende ulempene ved langsom frysing6,7.
Vitrifikasjon tilbyr en fordel over langsom frysing i at skaden på grunn av isdannelse er helt unngås ved en direkte faseovergang av vann i glass staten6. Men for å nå glasset overgangen temperatur på rent vann (-137 ° c), må vannet avkjøles ved hastigheter i den rekkefølgen av 1 000 000 grader Celsius per sekund (dvs. kritisk kjøle hastighet) for å unngå isdannelse over glasset overgangen temperatur8 . Tilsetting av CPAs kan senke den kritiske kjøle hastigheten og øke glass overgangen temperatur på vandige løsninger9. Men selv med høye CPA konsentrasjoner (f. eks, 40% v/v DMSO eller høyere) rask kjøling priser er likevel nødvendig for vellykket vitrifikasjon8,9.
De nødvendige avkjølings ratene og høye CPA-konsentrasjonene resulterer i to store ulemper ved vitrifikasjon. Først, for å muliggjøre rask kjøling, må prøvene ha en lav termisk masse. For det andre, å nå høye CPA konsentrasjoner samtidig unngå osmotisk Kader, CPAs må langsomt innføres og fullt equilibrated mellom intra-og ekstracellulære rom6. Dette øker eksponeringstiden av celler til giftig CPAs. Sammen gjør dette vitrifikasjon en tungvint prosess som er begrenset til noen små store prøver (mikroliter) om gangen. Dråpe vitrifikasjon har blitt foreslått som en potensiell løsning på disse restriksjonene. Ved å utsette minimale celle-Laden dråper (nanoliters) til flytende nitrogen kjøle hastigheten er betydelig økt, noe som følgelig gir en betydelig reduksjon i CPA-konsentrasjonen 10,11,12 ,13,14. Selv om flere avanserte dyser for høyfrekvent dråpe generering potensielt kan brukes samtidig, begrenser den ekstremt lille dråpestørrelsen gjennomstrømningen til mikroliter per minutt10, noe som utelukker effektiv vitrifikasjon av stor celle volumer med magnitudes høyere prosesserings rater på rekkefølgen av milliliter per minutt.
Nylig ble det demonstrert at disse iboende begrensninger av vitrifikasjon kan overvinnes ved bulk dråpe vitrifikasjon15. Denne romanen metoden utnytter rask osmotisk dehydrering å konsentrere en intracellulære CPA konsentrasjon av 7,5% v/v etylen glykol og DMSO umiddelbart foregående vitrifikasjon, eliminerer behovet for full likevekts av giftige CPA konsentrasjoner. Den cellulære dehydrering utføres i en fluidic enhet ved en kort eksponering av hepatocytter til en høy ekstracellulære CPA-konsentrasjon. Selv om denne eksponeringen forårsaker rask osmotisk dehydrering, er det for kort for den høye CPA-konsentrasjonen å spre inn i cellene. Umiddelbart etter dehydrering, er cellene lastet i dråper som er direkte vitrified i flytende nitrogen. Denne metoden eliminerer behovet for full intracellulære opptak av høye CPA-konsentrasjoner, mens den høye ekstracellulære-CPA-konsentrasjonen gjør det mulig å vitrifikasjon store størrelse dråper, noe som resulterer i høy gjennomstrømning volumer med minimal CPA toksisitet.
Dråpe vitrifikasjon forbedrer direkte og langsiktig levedyktighet etter bevaring, samt morfologi og metabolsk funksjon av primære rotte hepatocytter i forhold til klassisk kryonisk bevaring ved langsom frysing15. Dette manuskriptet gir metodisk detaljer for bulk dråpe vitrifikasjon av primær rotte hepatocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den primære hepatocytter isolasjoner for denne protokollen ble utført av Cell Resource Core (CRC) ved Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, USA. Dyret protokollen (#2011N000111) ble godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) av Massachusetts General Hospital.
1. bulk dråpe vitrifikasjon
- Klargjør vitrifikasjon løsninger.
- Tilsett 40 mg av storfe serum albumin (BSA) til 17,0 mL av University of Wisconsin løsning (UW) for å gjøre vitrifikasjon løsning 1 (v1). Sterilt filter v1-oppløsningen ved hjelp av et 0,22 μm-filter og oppbevares ved 4 ° c.
Merk: UW er en alminnelig brukt organ bevaring løsning. Den inneholder 50 g/L hydroxyethyl stivelse, 35,83 g/L laktobionsyre syre, 3,4 g/L kalium fosfat enbasisk, 1,23 g/L magnesium sulfat heptahydrat, 17,83 g/L raffinose pentahydrate, 1,34 g/L adenosin, 0,136 g/L allopurinol, 0,992 g/L total glutation, 5,61 g /L kalium natriumhydroksid, og natriumhydroksid å justere pH til 7,4. - Kombiner 7,0 mL av UW, 6,5 mL av DMSO, 6,5 mL etylen glykol (EG), 40 mg av BSA, og 5,48 g av sukrose for å gjøre vitrifikasjon løsning 2 (v2). Sterilt filter v2-løsningen med et 0,22 μm-filter. Last 3,5 mL av steril, filtrert v2-oppløsning i en 3 mL sprøyte og oppbevares ved 4 ° c.
Merk: for å lette oppløsningen av CPAs, er løsninger fremstilt i større mengder enn nødvendig.
- Tilsett 40 mg av storfe serum albumin (BSA) til 17,0 mL av University of Wisconsin løsning (UW) for å gjøre vitrifikasjon løsning 1 (v1). Sterilt filter v1-oppløsningen ved hjelp av et 0,22 μm-filter og oppbevares ved 4 ° c.
- Klargjør bulk dråpe vitrifikasjon apparat.
- For å forberede mikse pinnen, skjær først langs den ene siden av den ytre grå hylsen på mikse nålen, og bøy deretter hylsen for å fjerne den fra mikse nålen.
- Skyv 2 25 mm silikon rørseksjoner over viker på mikse nålen og sikre sin posisjon med lim (figur 1A).
- Klipp nålen til en lengde på 20 mm (dvs. lengden på den indre mikse spiralen) som vist i figur 1a.
Merk: blandings nålen er proporsjonal med volumet på innsiden av nålen, og kan derfor endres for å kontrollere eksponeringstiden for hepatocytter til den høye CPA-konsentrasjonen. - Sett inn utgangs uttaket på mikse nålen i en 20 G injeksjonsnål (figur 1B).
Merk: injeksjonsnål størrelsen påvirker dråpestørrelsen. - Sterilisere mikse nålen heten ved autoklavering.
- Fyll en steril Dewar med flytende nitrogen. Sterilisere utsiden av Dewar med isopropanol før du plasserer Dewar i en steril laminær strømningscelle kultur hette.
Merk: forurensning er en viktig faktor ved direkte eksponering av dråpene til flytende nitrogen. Selv om det ikke var noen forurensning ved bruk av ikke-sterilisert flytende nitrogen i den gjeldende protokollen, kan flytende nitrogen filtreres eller bestrålt for å sikre sterilitet ved behov16. - Sett inn en trakt med samme ytre diameter som den indre diameteren til den flytende nitrogen Dewar i et 50 ml konisk rør for å opprette dråpe oppsamlings enheten (figur 1C−E).
- Senk dråpeoppsamling enheten i flytende nitrogen ved langsomt å trykke den ned i sin endelige vertikal posisjon ved hjelp av store tang. Påse at det koniske røret hviler i vertikal posisjon nederst på Dewar (figur 1D−E).
Merk: trakten skal være satt inn og hviler på det koniske røret. Det flytende nitrogen nivået skal være 1 cm under innløps høyden på trakten, som vist i figur 1D. - Monter en sprøyte pumpe i en vertikal posisjon på veggen av cellen kultur panseret ved å binde en streng fra sprøyte pumpens føtter til skruer som stikker ut fra cellen kulturen panseret veggen.
- Plasser den flytende nitrogen Dewar med dråpeoppsamling enheten under den vertikalt monterte sprøyte pumpen (figur 1E).
- Pre-ruge med CPAs.
- Etter å ha innhentet fersk isolert rotte hepatocytter, telle aksjen konsentrasjon av Trypan blå eksklusjon og ta 40 000 000 levedyktig hepatocytter.
Merk: skånsom håndtering av hepatocytter i suspensjon er avgjørende for å hindre celle død. - Sentrifuger ved 50 x g i 5 min uten brems.
- Aspirer supernatanten og resuspend hepatocytter i 3,4 mL v1-oppløsning.
- Ruge på isen i 3 min.
- Tilsett 150 μL av DMSO og 150 μL av EG til hepatocytter og bland forsiktig.
- Ruge på isen i 3 min.
- Igjen, tilsett 150 μL av DMSO og 150 μL av EG til hepatocytter og bland forsiktig.
- Last 3,5 mL i en 3 mL sprøyte.
- Etter å ha innhentet fersk isolert rotte hepatocytter, telle aksjen konsentrasjon av Trypan blå eksklusjon og ta 40 000 000 levedyktig hepatocytter.
- Utfør vitrifikasjon.
- Sett inn sprøyten med inkubert hepatocytter og v2-løsnings sprøyter på sprøyte pumpe adapteren.
- Fest to kvinnelige luer låse slange Barb adaptere til sprøyter og skyv silikon slangen av mikse nålen forsamlingen over Barb beslag (figur 1F).
- Plasser hele forsamlingen i sprøyte pumpen (figur 1E).
- Tre min etter den siste tillegg av DMSO og EG til hepatocytter, starter pumpen ved 2 mL/min.
- Stopp pumpen etter at alle hepatocytter har blitt tilsatt til flytende nitrogen.
2. kryogene lagring
- Punktering 10 små hull i lokket på en 50 mL konisk rør ved hjelp av en 20 G nål og vikle utsiden av lokket med en fleksibel film, som vist i figur 1B. Dette skaper en ventil som gjør det mulig å unnslippe fordamper leftover flytende nitrogen.
- For å samle inn vitrified hepatocytter dråper, må du først fjerne trakten fra væsken nitrogen Dewar. Deretter bruker lang tang for å ta den koniske rør som inneholder dråper ut av flytende nitrogen og langsomt helle ut overflødig flytende nitrogen fra konisk tube.
- Lukk konisk rør med punktert lokk og direkte plassere lukket konisk rør med vitrified hepatocytter dråper tilbake i flytende nitrogen Dewar.
- Overfør den koniske slangen fra den flytende nitrogen til en flytende nitrogendamp cryotank.
3. Rewarming av vitrified hepatocytter dråper
-
Forbered rewarming løsningen.
- Løs opp 17,13 g av sukrose i 100 mL av DMEM hepatocytter kultur Media for å gjøre den rewarming løsningen. Sterilt filter rewarming oppløsning ved bruk av et 0,22 μm filter og varm til 37 ° c.
-
Rewarm hepatocytter.
- Ta det koniske røret med vitrified hepatocytter fra cryotank og transporter det i et flytende nitrogen Dewar til cellekultur panseret.
- Løsne hetten forsiktig og sett den koniske slangen tilbake i det flytende nitrogen.
- Tilsett vitrified hepatocytter dråper i et tomt beger, Legg umiddelbart til den varme (37 ° c) rewarming løsningen, og rør umiddelbart i 10 s.
Merk: det er viktig å arbeide raskt for å unngå frysing under rewarming. Avhengig av studie kravene, kan noen få til alle vitrified dråper være rewarmed på en gang.
-
Last ut den rewarming løsningen.
- Del den rewarming løsningen med hepatocytter over 2 50 mL koniske rør.
- Sentrifuger de to koniske rørene i 2 minutter ved 100 x g ved 4 ° c uten brems.
- Aspirer supernatanten til å etterlate et samlet volum på 12,5 mL ved hjelp av det koniske røret som en referanse og tilsett 12,5 mL iskald DMEM per konisk rør for å fortynne den rewarming løsningen til 50%.
- Resuspend hepatocytter og ruge på isen i 3 min.
- Tilsett 25 mL iskald DMEM per konisk rør for å fortynne den rewarming løsningen til 25%.
- Sentrifuger for 5 min ved 50 x g ved 4 ° c uten brems.
- Aspirer supernatanten og resuspend hepatocytter i 2 mL av ønsket kultur medium for bruk.
Merk: tetthet gradient sentrifugering kan brukes til å fjerne døde hepatocytter fra celle suspensjonen hvis ønskelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Frisk isolere primære hepatocytter fra fem annerledes rotten lever var anvendt for en direkte sammenligningen av bulk dråpe vitrifikasjon å klassisk kryonisk bevaring benytter det fremragende langsom-fryser protokoller rapportere inne litteraturen4, 5. kort sagt, ble hepatocytter suspendert i UW supplert med BSA (2,2 mg/ml), glukose (333 mm), og DMSO (10% v/v) og frosset med en kontrollert hastighet fryser. Etter lagring ved-196 ° c, ble prøvene tint i et varmt vannbad. Etter at alle isen smeltet, ble DMSO direkte utvannet mens glukose konsentrasjonen ble gradvis senket under flere trinn for å redusere osmotisk Kader. Den nøyaktige protokollen kan bli funnet i detalj andre steder15. Bevaring varigheter varierte fra 2 til 8 dager og ble matchet mellom bulk dråpe vitrifikasjon og frysing kryonisk bevaring for hver biologiske gjenskape å sikre lik sammenligning. Selv om kortere bevarings tider ble testet for praktiske hensyn, bør det bemerkes at primær hepatocytter kan lagres ved-196 ° c i årevis uten tap av levedyktighet5.
Bulk dråpe vitrifikasjon resulterer i et direkteinnlegg bevaring hepatocytter levedyktighet på 79%, målt ved Trypan blå ekskludering testing, som bestemmer membran integritet (figur 2a). Dette er betydelig høyere enn 68% levedyktighet etter klassisk optimalisert kryonisk bevaring. Avkastningen av bulk dråpe vitrifikasjon er 56% som er 10% høyere, og viktigere mer konsistent, sammenlignet med klassiske kryonisk bevaring (figur 2B).
Den metabolske aktiviteten av hepatocytter, målt ved hjelp av en Presto Blue metabolization essay i langsiktige kollagen sandwich kulturer, var betydelig høyere etter bulk dråpe vitrifikasjon enn etter klassisk kryonisk bevaring. Albumin syntese, som er den mest brukte parameter for syntetisk funksjon av hepatocytter, var større med nesten to ganger etter bulk dråpe vitrifikasjon i forhold til klassisk kryonisk bevaring (Figur 3A). Urea produksjon er den mest brukte parameter for hepatocytter avgiftning funksjon. Etter en ukes kultur, urea produksjon av bulk dråpe vitrified hepatocytter var signifikant høyere enn for klassisk embryo hepatocytter (Figur 3B).
Oppsummert bulk dråpe vitrifikasjon forbedrer direkte post-bevaring levedyktighet og langsiktig metabolske funksjon av primær rotte hepatocytter i kollagen sandwich kulturer, sammenlignet med kryonisk bevaring ved langsom frysing.
Figur 1: bulk dråpe vitrifikasjon eksperimentell oppsett.
(A) illustrasjon av hvordan å forberede mikse nålen og feste to silikon slange seksjoner til viker på mikse nålen. (B) illustrasjon av innsetting av kuttet blande nålen i injeksjonsnålen å fullføre blanding nålen forsamlingen. (C) illustrasjon av trakten og 50 ml konisk slange som utgjør dråpe oppsamlings enheten. (D) skisse viser posisjonen til det koniske røret, trakten og det flytende nitrogen nivået i Dewar. (E) representasjon av den komplette eksperimentelle bulk dråpe vitrifikasjon oppsett fra bunn til topp: flytende nitrogen Dewar (grå); dråpeoppsamling enheten som er plassert inne i flytende nitrogen Dewar (klar); mikse pinnen (klar-gul) som er festet til sprøyter som er plassert i sprøyte pumpen (rød). (F) illustrasjon av sprøyter og blandings nål montering. To 3 mL sprøyter klemmes inn i sprøyte pumpe adapteren (blå); en sprøyte skal fylles med pre-inkubert hepatocytter i v1 løsning og den andre med høy CPA konsentrasjon løsning (v2 løsning). Blandingen nål forsamlingen er festet til sprøyter av to kvinnelige luer låse slangen Barb adaptere. (G) illustrasjon av hvordan du oppretter det koniske røret lokket for kryogene lagring som gjør at leftover fordamper flytende nitrogen å flykte fra det koniske røret under lagring av vitrified hepatocytter dråper. Topp: lokk med punktert hull. Under: punktert lokk innpakket med fleksibel film. Vektstenger: 1 cm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: hepatocytter levedyktighet og utbytte etter bevaring.
(A) levedyktighet av fersk (grå), embryo (blå), og bulk dråpe vitrified (grønn) hepatocytter. (B) bevaring yield av embryo og bulk dråpe vitrified hepatocytter. Stjerner: p < 0,05 (Wilcoxon matchet-parene signert rang test). Kinnskjegg: min til maks. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: metabolsk aktivitet i langsiktige kollagen sandwich kulturer.
(A) albumin syntese av fersk (grå), embryo (blå), og bulk dråpe vitrified (grønn) hepatocytter på kultur dager 3, 5, og 7. (B) urea produksjon av ferske, embryo, og bulk dråpe vitrified hepatocytter. Stjerner: p < 0,05 (sammenkoblet enveis Anova etterfulgt av Tukey korreksjon for flere tester). Feilfelt: standardavvik. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kryonisk bevaring av hepatocytter ved langsom frysing resulterer i redusert levedyktighet og metabolsk funksjon. Vitrifikasjon tilbyr et lovende alternativ for klassisk kryonisk bevaring, som frysing skade er helt unngått9. Men, pre-inkubasjons med CPAs er nødvendig for å senke den kritiske kjøle hastighet8. Følgelig blir vitrifikasjon hemmet av CPA-toksisitet17 og begrenset til små prøve volumer. I arbeidet med å overkomme disse begrensningene ble det utviklet en vitrifikasjon metode som ble presentert i dette manuskriptet for å muliggjøre vitrifikasjon av store mengder celler, mens man brukte en lav pre-inkubert CPA-konsentrasjon15. Denne bulk dråpe vitrifikasjon fører til økt hepatocytter levedyktighet og metabolsk funksjon i forhold til den mest optimale sakte frysing kryonisk bevaring metode i litteraturen. Her er de omfattende metodene for bulk dråpe vitrifikasjon og detaljert innsikt i de praktiske aspektene ved prosedyrene gitt.
Flere trinn i protokollen er kritiske og krever ekstra oppmerksomhet. Fylling av Dewar med ikke-sterilisert flytende nitrogen potensielt fører til semi-sterile forhold. Ved hjelp av forholdsreglene forklart i protokollen, ble det ikke avdekket forurensning i løpet av vår langsiktige kollagen sandwich kulturer. Imidlertid kan ytterligere steriliserings tiltak tas hvis det anses nødvendig. Flytende nitrogen kan steriliseres ved stråling eller filtrering16 og systemet kan være helt lukket med et lokk på flytende nitrogen Dewar med en skorstein koblet til mikse nålen. Alternativt, ikke-kontakt dråpe vitrifikasjon metoder kan utforskes, selv om dette kan begrense større volum gjennomstrømming14.
Andre vesentlige deler av protokollen er CPA pre-lasting og lossing inkubasjons varigheter. Lengre varighet kan føre til giftig CPA-skade mens kortere varighet kan forårsake osmotisk Kader. Det er også viktig å sikre at vitrified hepatocytter dråpene alltid under glass overgangs temperaturen fordi ukontrollert makro-og mikroskopisk is kjernedannelse ved høyere temperaturer fører til alvorlig hepatocytter Kader og celle død. Fra et praktisk perspektiv, er det mest kritiske trinnet i bulk dråpe vitrifikasjon rewarming av vitrified hepatocytter dråper. Når vitrified dråper er fjernet fra flytende nitrogen de kan fryse i løpet av sekunder hvis ikke raskt rewarmed ved umiddelbart å legge den varme rewarming løsning.
Fremtidig optimalisering av bulk dråpe vitrifikasjon kan ytterligere forbedre bevaring utfall, slik som levedyktighet, yield, og metabolske funksjon. Både gjennomtrengelig og ikke-gjennomtrengelig CPAs kan testes for å optimalisere osmotisk dehydrering foran vitrifikasjon. Dette kan redusere osmotisk sjokk under dehydrering og kan også tillate å redusere pre-inkubert CPA konsentrasjoner. I tillegg, kontinuerlig fluidic, i stedet for batchwise, CPA pre-inkubasjons ville teoretisk sett tillate vitrifikasjon av ubegrenset celle mengder. Fordi bare generelt laboratorieutstyr er nødvendig for bulk dråpe vitrifikasjon, er det en enkel og kostnadseffektiv bevarings metode som potensielt kan brukes til bevaring av andre celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer konkurrerende økonomiske interesser. DRS. de Vries, Weng, toner, Tessier, og Uygun har foreløpige patentsøknader relevant for denne studien. Dr. Uygun har en finansiell interesse i organ Solutions, et selskap som fokuserer på å utvikle organ bevaring teknologi. Alle forsker interesser forvaltes av MGH og Partners HealthCare i samsvar med deres interessekonflikt politikk.
Acknowledgments
Finansiering fra det amerikanske National Institutes of Health (R01DK096075, R01DK107875, og R01DK114506) og det amerikanske Department of Defense (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) er sterkt anerkjent.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| Beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000-250 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | BUW-001 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP | Cole-Parmer | EW-45508-12 | |
| Cryogentic stroage tank / Cryotank | Chart Industries | MVE 800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 12800-082 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 107-21-1 | |
| Extra long forceps | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes - Flat top closure | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| Fishing line | Stren | SOFS4-15 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | 7727-37-9 | |
| Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | |
| Mix Tips, For Use With 3HPW1 | Grainger | 3WRL7 | |
| Nalgene Polypropylene Powder Funnel | ThermoFisher | 4252-0100 | |
| Needle 20 ga | Becton Dickinson (BD) | 305175 | |
| Parafilm M - Flexible film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Spatula | Cole-Parmer | EW-06369-18 | |
| Steriflip sterile filter | Fisher Scientific | SE1M179M6 | |
| Sucrose (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container | ThermoFisher | 2122 |
References
- Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. Artificial and bioartificial liver devices: present and future. Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).
- Fox, I. J., Chowdhury, J. R.
- Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A.
- Stéphenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy. World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).
- Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation. Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).
- Pegg, D. E.
- Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. Cryopreservation: An emerging paradigm change. Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).
- Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions. Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).
- Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. Vitrification as an approach to cryopreservation. Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).
- Demirci, U., Montesano, G.
- El Assal, R., et al. Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification. Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).
- Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-μl drops using inkjet printing--cryoprinting. Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).
- Samot, J., et al.
- Shi, M., et al. High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing. Scientific Reports. 5 (1), (2016).
- de Vries, R. J., et al. Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome. Langmuir. , (2019).
- Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
- Best, B. P. Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).
