Imagerie en temps réel de bioluminescence de la dynamique de signalisation d'encoche pendant la neurogenèse de Murine
Summary
Les cellules neurales de tige/progéniteur montrent la dynamique diverse d’expression des composants de signalisation de notch qui mènent aux résultats différents des événements cellulaires. Une telle expression dynamique peut être révélée par une surveillance en temps réel, et non par une analyse statique, à l’aide d’un système d’imagerie de bioluminescence très sensible qui permet de visualiser des changements rapides dans les expressions génétiques.
Abstract
La signalisation d’entaille régule le maintien des cellules neurales de tige/progénitrice par des interactions cellules-cellules. Les composants de la signalisation Notch présentent une expression dynamique. L’effecteur de signalisation d’entaille Hes1 et le Notch ligand Delta-like1 (Dll1) sont exprimés d’une manière oscillatoire dans les cellules neurales de tige/progénitrice. Parce que la période de l’expression oscillatoire de ces gènes est très courte (2 h), il est difficile de surveiller leur expression cyclique. Pour examiner ces changements rapides dans l’expression des gènes ou la dynamique des protéines, des journalistes d’intervention rapide sont nécessaires. En raison de sa cinétique de maturation rapide et de sa sensibilité élevée, la luciférase de journaliste de bioluminescence est appropriée pour surveiller les changements rapides d’expression de gène dans les cellules vivantes. Nous avons employé un journaliste déstabilisé de luciferase pour surveiller l’activité de promoteur et un journaliste luciferase-fused pour visualiser la dynamique de protéine à la résolution simple de cellules. Ces reporters de bioluminescence montrent un chiffre d’affaires rapide et génèrent des signaux très faibles; par conséquent, nous avons développé un système d’imagerie de bioluminescence très sensible pour détecter de tels signaux faibles. Ces méthodes nous permettent de surveiller diverses dynamiques d’expression génique dans les cellules et les tissus vivants, qui sont des informations importantes pour aider à comprendre les états cellulaires réels.
Introduction
Le cerveau des mammifères est composé d’un grand nombre de différents types de neurones et de cellules gliales. Toutes les cellules sont générées à partir de cellules neurales souches/progénitrices (PNJ), qui prolifèrent d’abord pour augmenter leur nombre, puis commencent à se différencier en neurones, et finalement donner naissance à des cellules gliales1,2,3,4,5. Une fois que les cellules se sont différenciées en neurones, elles ne peuvent pas proliférer ou augmenter leur nombre, et, par conséquent, le maintien des PNJ jusqu’à des stades ultérieurs est important. La signalisation d’entaille par l’intermédiaire des interactions cellule-cellule joue un rôle important en maintenant des PNJ6,7. Les ligands d’entaille interagissent avec la protéine membranaire, Notch, à la surface des cellules voisines et activent la protéine Notch. Après l’activation, la protéolyse de la protéine Notch se produit, libérant ainsi le domaine intracellulaire de Notch (NICD) de la membrane cellulaire dans le noyau8,9,10. Dans le noyau, NICD se lie aux régions promotrices de Hes1 et Hes5 (Hes1/5) et active l’expression de ces gènes. Hes1/5 réprimer l’expression des gènes proneural Ascl1 et Neurogenin1 /2 (Neurog1/2)11,12,13,14. Puisque les gènes proneural induisent la différenciation neuronale, Hes1/5 jouent des rôles essentiels en maintenant des PNJ. En outre, comme les gènes proneural peuvent activer l’expression de la Notch ligand Delta-like1 (Dll1), Hes1/5 également réprimer l’expression de Dll1. Par conséquent, l’expression de Dll1 conduit à des cellules voisines étant négative pour Dll1 via Notch signalisation. De cette façon, les cellules inhibent les cellules adjacentes de suivre leur même sort, un phénomène connu sous le nom d’inhibition latérale8. Dans le cerveau en développement, l’inhibition latérale joue un rôle dans la génération de différents types de cellules.
L’imagerie en temps réel au niveau des cellules individuelles révèle des expressions dynamiques des composants de la signalisation Notch dans les PNJ15,16,17. La signalisation d’encoche active l’expression de Hes1, mais la protéine Hes1 se lie à son propre promoteur et réprime sa propre expression. En outre, Hes1 est une protéine extrêmement instable, qui est dégradée par la voie ubiquitine-protéasome ; par conséquent, la répression de son propre promoteur n’est que de courte durée et la transcription recommence. De cette façon, l’expression de Hes1 oscille à la fois au niveau de la transcription et de la traduction dans un cycle de 2 h18. L’expression oscillatoire de Hes1, à son tour, induit l’expression oscillatoire des gènes cibles en aval, tels que Ascl1, Neurog2, et Dll1, par la répression périodique15,16,17,19. Tandis que les gènes proneural peuvent induire la différenciation neuronale, leur expression oscillatoire n’est pas suffisante pour la différenciation neuronale ; leur expression soutenue est plutôt essentielle à la différenciation neuronale. L’expression oscillatoire des gènes proneural est importante pour maintenir des PNJ plutôt que pour induire la différenciation neuronale14,15,16. L’expression de Dll1 oscille à la fois aux niveaux de transcription et de traduction au cours de diverses morphogenèses, telles que la neurogenèse et la somitogénèse. L’expression dynamique de Dll1 est importante pour la morphogénèse normale et l’expression régulière de Dll1 induit des défauts dans la neurogenèse et la somitogenèse17. Ces résultats démontrent la fonction importante que la dynamique de l’expression génique et de la cinétique protéique ont sur la régulation de divers événements développementaux (c.-à-d., différentes dynamiques d’expression produisent des sorties différentes dans les comportements cellulaires).
Pour analyser la dynamique de la signalisation Notch, l’analyse statique des tissus et des cellules est insuffisante parce qu’ils sont en constante évolution. L’imagerie en temps réel des cellules individuelles est un outil puissant pour révéler la dynamique de l’expression des gènes. L’expression dynamique des molécules de signalisation Notch subissent des réponses cycliques rapides dans la période de 2-3 h. Cette expression périodique rapide présente deux problèmes difficiles pour la surveillance en temps réel : (1) l’expression des molécules est supprimée à de faibles niveaux, et (2) le roulement rapide exige des journalistes de réponse rapide. Pour surmonter ces problèmes, nous avons déjà développé une méthode d’imagerie en temps réel de bioluminescence20. Parce que le journaliste de bioluminescence a une sensibilité plus élevée et un temps de maturation plus court que les journalistes fluorescents, cette stratégie nous permet de surveiller la dynamique rapide dans les cellules vivantes. En utilisant la visualisation en temps réel, nous avons constaté que plus de gènes présentaient une expression dynamique que nous ne le pensions auparavant. En outre, le nombre de rapports montrant l’expression et la dynamique des protéines dans les cellules vivantes et l’importance de ces dynamiques dans divers événements biologiques a augmenté, suggérant un rôle fondamental de la dynamique dans les expressions génétiques21,22.
Dans ce rapport, nous décrivons une manière de visualiser l’expression du Ligand de Notch Dll1 dans les PNJ dans les cultures dissociées et dans les cultures corticales de tranche. Pour surveiller la dynamique de la transcription de Dll1 aux niveaux de cellules simples, nous avons produit des cultures dissociées des PNJ dérivées du telencephalon embryonnaire des souris transgéniques portant le journaliste de pDll1-Ub-Fluc, un journaliste de luciferase déstabilisé d’Un promoteur Dll1. Pour surveiller la dynamique des protéines Dll1 in vivo, nous avons introduit le journaliste de fusion Dll1-Fluc dans les PNJ dans le cortex et visualisé l’expression du journaliste dans les PNJ dans les cultures de tranches corticales. L’imagerie en temps réel nous a permis de saisir les diverses caractéristiques de l’expression génique et de la dynamique des protéines dans les cellules vivantes à haute résolution temporelle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les composants de la signalisation Notch montrent des expressions oscillatoires en synchronie pendant la somitogénèse mais hors de synchronie pendant la neurogenèse, conduisant aux difficultés dans la capture de la dynamique d’expression par l’analyse statique dans ce dernier cas. Ainsi, une surveillance en temps réel est nécessaire pour révéler la dynamique d’expression des composants de signalisation Notch, tels que Hes1 et Dll1. Parce que les périodes des expressions des oscillations Hes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Yumiko Iwamoto d’avoir soutenu la production de la vidéo. Nous sommes également reconnaissants à Akihiro Isomura pour la discussion et le soutien de l’analyse d’image, Hitoshi Miyachi pour les soutiens techniques pour la génération d’animaux transgéniques, Yuji Shinjo (Olympus Medical Science), Masatoshi Egawa (Olympus Medical Science), Takuya Ishizu ( Olympus Medical Science) et Ouin Kunitaki (Andor Japon) pour le soutien technique et les discussions du système d’imagerie de bioluminescence. Ce travail a été soutenu par Core Research for Evolutional Science and Technology (JPMJCR12W2) (R.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (MEXT 24116705 for H.S. et MEXT 16H06480 for R.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (JSPS) (JSPS) 18K06254) (H.S.), Takeda Foundation (R.K. et H.S.), et Platform for Dynamic Approaches to Living System du Ministère de l’éducation, de la culture, des sports, des sciences et de la technologie, Japon.
Materials
| Bioluminescence Imaging System | |||
| Chilled water circulator (chiller) | Julabo | Model: F12-ED | |
| Cooled CCD camera | Andor Technology | Model: iKon-M 934 | |
| Incubator system | TOKAI HIT | Model: INU-ONICS | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX81 | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX83 | |
| LED illumination device | CoolLED | Model: pE1 | |
| MetaMorph | MOLECULAR DEVICES | Model: 40000 | |
| Mix gas controller | Tokken | Model: TK-MIGM OLO2 | |
| Objective lens | Olympus | Model: UPLFLN 40X O | |
| Preparations for Dissection | |||
| Dissection microscope | Nikon | Model: SMZ-2B | |
| Fluorescence stereoscopic microscope | Leica | Model: MZ16FA | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Scissors, Micro scissors | |||
| Forceps | |||
| Ring-shaped forceps | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Reagents for NPC dissociation culture | |||
| B27 supplement | invitrogen | 12587-010 | |
| bFGF | invitrogen | 13256-029 | Stock solution: 1 μg/ml in 0.1% BSA/PBS |
| D-luciferin | Nacalai Tesque | 01493-85 | Stock solution: 100mM in 0.9% saline |
| DNase | Worthington Biochemical Corporation | LK003172 | Stock solution: 1000U/ml in EBSS |
| EBSS | Worthington Biochemical Corporation | LK003188 | |
| Glass bottom dish | IWAKI | 3910-035 | |
| N2 supplement (100x) | invitrogen | 17502-048 | |
| N-acetyl-cystein | Sigma | A-9165-25G | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LK003178 | Stock solution: 7U/ml in EBSS |
| Penicillin/Streptmycine | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P-6281 | 40 mg/ml in DW |
| Preparations for in utero electroporation | |||
| 50-ml syringe | TERUMO | 181228T | |
| Electrode | Neppagene | 7-mm | |
| Electroporator | Neppagene | CUY21 EDIT | |
| Forceps | |||
| Gauzes | Kawamoto co. | 7161 | |
| Micro capillary | Made in-house | ||
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Pentbarbital | Kyoritsuseiyaku | Somnopentyl | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Suture needle | Akiyama MEDICAL MFG. CO | F17-40B2 | |
| Xylazine | Bayer | Seractal | |
| Preparations for Slice culture | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| Culture insert | Millipore | PICM01250 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 172012-500ML | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Forceps | |||
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Micro surgical knife | Alcon | 19 Gauge V-Lance | |
| Multi-gas incubator | Panasonic | MCO-5MUV-PJ | |
| N2/B27 media | Made in-house | ref. NPC dissociatioin culture | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Silicon rubber cutting board | Made in-house |
References
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