JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Биолюминесценция в режиме реального времени Визуализация динамики сигнализации во время Нейрогенеза Murine

Published: December 12, 2019
doi:
10.3791/60455
,
1Institute for Frontier Life and Medical Sciences,Kyoto University, 2Institute for Integrated Cell-Material Sciences (iCeMS),Kyoto University, 3Kyoto University Graduate School of Medicine, 4Kyoto University Graduate School of Biostudies

Summary

Нейронные стволовые/клетки-прародители демонстрируют различную экспрессионную динамику сигнальных компонентов Notch, которые приводят к различным исходам клеточных событий. Такое динамическое выражение может быть выявлено путем мониторинга в реальном времени, а не статического анализа, с использованием высокочувствительной биолюминесценционной системы визуализации, которая позволяет визуализировать быстрые изменения в экспрессии генов.

Abstract

Сигнализация notch регулирует обслуживание нервных клеток ствола/прародителя взаимодействиями клетки-клетки. Компоненты сигнализации Notch демонстрируют динамическое выражение. Эффектор сигнала Hes1 и Notch ligand Delta-like1 (Dll1) выражены в колебательной манере в нервных стволовых/прагениторных клетках. Поскольку период колебательной экспрессии этих генов очень короткий (2 ч), трудно контролировать их циклическое выражение. Для изучения таких быстрых изменений в экспрессии гена или динамике белка требуется быстрая реакция репортеров. Из-за его быстрой кинетики созревания и высокой чувствительности, биолюминесценция репортер luciferase подходит для мониторинга быстрых изменений экспрессии генов в живых клетках. Мы использовали дестабилизированный репортер люциферазы для мониторинга активности промоутера и luciferase-слитый репортер для визуализации динамики белка с разрешением одной клетки. Эти биолюминесценции репортеры показывают быстрый оборот и генерировать очень слабые сигналы; поэтому мы разработали высокочувствительную систему визуализации биолюминесценции для обнаружения таких слабых сигналов. Эти методы позволяют нам контролировать различные динамики экспрессии генов в живых клетках и тканях, которые являются важной информацией, чтобы помочь понять фактические клеточные состояния.

Introduction

Мозг млекопитающих состоит из большого количества различных типов нейронов и глиальных клеток. Все клетки генерируются из нервных стволовых / прародителей клеток (NPCs), которые сначала размножаются, чтобы расширить их число, затем начинают дифференцироваться в нейроны, и, наконец, привести к глиальных клеток1,2,3,4,5. После того, как клетки дифференцированы в нейроны, они не могут размножаться или увеличивать их число, и, следовательно, поддержание NpCs до более поздних стадиях имеет важное значение. Прочка сигнализации через ячейки взаимодействия играет важную роль в поддержании NPCs6,7. Выемка лиганды взаимодействуют с мембранным белком, Notch, на поверхности соседних клеток и активирует белок Notch. После активации происходит протеоз белка Notch, тем самым высвобождая внутриклеточное достояние Notch (NICD) из клеточной мембраны в ядро8,9,10. В ядре NICD связывается с областями промотора Hes1 и Hes5 (Hes1/5) и активирует экспрессию этих генов. Hes1/5 подавляют экспрессию проневрюкгенных генов Ascl1 и Neurogenin1 (Neurog1/2)11,12,13,14. Поскольку проневральные гены вызывают дифференциацию нейронов, Hes1/5 играет важную роль в поддержании NPC. Кроме того, поскольку проневрюновые гены могут активировать экспрессию Нотх лиганда Дельта-like1 (Dll1), Hes1/5 также подавляет экспрессию Dll1. Таким образом, выражение Dll1 приводит к тому, что соседние клетки являются отрицательными для Dll1 через Сигнализацию Notch. Таким образом, клетки ингибируют соседние клетки от следующих их же судьбы, явление, известное как боковое ингибирование8. В развивающемся мозге боковое ингибирование играет роль в генерации различных типов клеток.

Визуализация в режиме реального времени на уровне одной клетки показывает динамические выражения компонентов сигнализации Notch вNPC 15,16,17. Прочка сигнализации активизирует выражение Hes1, но Hes1 белка связывается с собственным промоутером и подавляет свое собственное выражение. Кроме того, Hes1 является чрезвычайно нестабильным белком, который деградирует убиквитин-протеасомы пути; поэтому, репрессии своего собственного промоутера только недолго, а затем транскрипция начинается снова. Таким образом, выражение Hes1 колеблется как на транскрипции, так и на переводном уровне в цикле182 ч. Колеблящее выражение Hes1, в свою очередь, индуцирует колебальное выражение нюшенных генов, таких как Ascl1, Neurog2, и Dll1, через периодические репрессии15,16,17,19. В то время как проневральные гены могут вызвать дифференциацию нейронов, их колебательная экспрессия недостаточна для дифференциации нейронов; а их устойчивое выражение имеет важное значение для дифференциации нейронов. Колеблющее выражение проневральных генов важно для поддержания NPC, а не для индуцирования дифференциации нейронов14,15,16. Выражение Dll1 колеблется как на транскрипции, так и на переводном уровне при различных морфогенезах, таких как нейрогенез и сомитогенез. Динамическое выражение Dll1 важно для нормального морфогенеза и устойчивое выражение Dll1 вызывает дефекты в нейрогенезе и сомитогенезе17. Эти выводы демонстрируют важную функцию, которую динамика экспрессии генов и кинетики белка оказывают на регуляцию различных событий развития (т.е. различная динамика экспрессии производит различные выходы в клеточном поведении).

Для анализа динамики сигнализации Notch статического анализа тканей и клеток недостаточно, так как они постоянно меняются. В режиме реального времени изображение одиночных клеток является мощным инструментом для выявления динамики экспрессии генов. Динамическое выражение сигнальных молекул Notch подвергается быстрым циклическим реакциям в период 2-3 ч. Это быстрое периодическое выражение представляет две трудные проблемы для мониторинга в реальном времени: (1) выражение молекул подавляется до низких уровней, и (2) быстрый оборот требует быстрого реагирования репортеров. Чтобы преодолеть эти проблемы, мы ранее разработали метод визуализации биолюминесценции в режиме реального времени20. Поскольку биолюминесценция репортер имеет более высокую чувствительность и короче время созревания, чем флуоресцентные репортеры, эта стратегия позволяет нам контролировать быструю динамику в живых клетках. Используя визуализацию в реальном времени, мы обнаружили, что больше генов обладают динамическим экспрессией, чем мы думали ранее. Кроме того, увеличилось количество сообщений, показывающих экспрессию и белковую динамику в живых клетках и значение этой динамики в различных биологических событиях, что свидетельствует о фундаментальной роли динамики в экспрессиях генов21,22.

В этом отчете мы описываем способ визуализации выражения Notch ligand Dll1 в NPC как в разобщенных культурах, так и в корковых срезанных культурах. Для мониторинга динамики транскрипции Dll1 на уровне одной клетки, мы создали разъединенные культуры NPCs, полученные из эмбрионального теленефалиона трансгенных мышей, несущих pDll1-Ub-Fluc репортер, Dll1 промоутер-управляемый дестабилизированной люциферазы репортер. Для мониторинга динамики белка Dll1 in vivo мы ввели репортера о слиянии Dll1-Fluc в NPC в коре головного мозга и визуализировали экспрессию репортера в NPC в корковых срезанных культурах. Изображения в режиме реального времени позволили нам запечатлеть различные особенности экспрессии генов и белковую динамику в живых клетках с высоким временным разрешением.

Protocol

Все процедуры, включая предметы животного, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию в Институте пограничной жизни и медицинских наук Киотского университета. 1. Биолюминесценция репортеров ПРИМЕЧАНИЕ: Лучифераза реп?…

Representative Results

Выражения генов Hes1/7 exhibit 2 h цикл колебаний в различных линиях клетки и во время somitogenesis. Кроме того, период колебаний очень короткий, и их мРНК и белки крайне нестабильны с периодом полураспада около 20 мин. При использовании репортера медленной реакции мы не можем проследить такую бы…

Discussion

Компоненты Нотча сигнализации показывают колеблющиеся выражения синхронно во время сомитогенеза, но из синхронности во время нейрогенеза, что приводит к трудностям в захвате динамики выражения статический анализ в последнем случае. Таким образом, мониторинг в реальном времени необх?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Yumiko Iwamoto за поддержку производства видео. Мы также благодарны Акихиро Исомуре за обсуждение и поддержку анализа изображений, Хитоси Мияти за техническую поддержку для генерации трансгенных животных, Yuji Shinjo (Olympus Medical Science), Масатоси Эгава (Olympus Medical Science), Такуя Исидзу ( Olympus Medical Science) и Уин Кунитаки (Андор Япония) для технической поддержки и обсуждения биолюминесценционной системы визуализации. Эта работа была поддержана Core Research for Evolutional Science and Technology (JPMJCR12W2) (R.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (MEXT 24116705 для H.S. и MEXT 16H06480 для R.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (JSPS) (JSPS) 18K06254 ( H.S.), Фонд Такэда (R.K. и H.S.), а также Платформа для динамических подходов к живой системе от Министерства образования, культуры, спорта, науки и техники, Япония.

Materials

Bioluminescence Imaging System
Chilled water circulator (chiller) Julabo Model: F12-ED
Cooled CCD camera Andor Technology Model: iKon-M 934
Incubator system TOKAI HIT Model: INU-ONICS
Inverted microscope Olympus Model: IX81
Inverted microscope Olympus Model: IX83
LED illumination device CoolLED Model: pE1
MetaMorph MOLECULAR DEVICES Model: 40000
Mix gas controller Tokken Model: TK-MIGM OLO2
Objective lens Olympus Model: UPLFLN 40X O
Preparations for Dissection
Dissection microscope Nikon Model: SMZ-2B
Fluorescence stereoscopic microscope Leica Model: MZ16FA
Fine forceps DUMONT INOX No.5
Scissors, Micro scissors
Forceps
Ring-shaped forceps
10-cm plastic petri dish greiner 664160-013
35-mm plastic petri dish greiner 627160
PBS Nacalai Tesque 14249-24
DMEM/F12 invitrogen 11039-021
Reagents for NPC dissociation culture
B27 supplement invitrogen 12587-010
bFGF invitrogen 13256-029 Stock solution: 1 μg/ml in 0.1% BSA/PBS
D-luciferin Nacalai Tesque 01493-85 Stock solution: 100mM in 0.9% saline
DNase Worthington Biochemical Corporation LK003172 Stock solution: 1000U/ml in EBSS
EBSS Worthington Biochemical Corporation LK003188
Glass bottom dish IWAKI 3910-035
N2 supplement (100x) invitrogen 17502-048
N-acetyl-cystein Sigma A-9165-25G
Papain Worthington Biochemical Corporation LK003178 Stock solution: 7U/ml in EBSS
Penicillin/Streptmycine Nacalai Tesque 09367-34
Poly-L-lysine Sigma P-6281 40 mg/ml in DW
Preparations for in utero electroporation
50-ml syringe TERUMO 181228T
Electrode Neppagene 7-mm
Electroporator Neppagene CUY21 EDIT
Forceps
Gauzes Kawamoto co. 7161
Micro capillary Made in-house
PBS Nacalai Tesque 14249-24
Pentbarbital Kyoritsuseiyaku Somnopentyl
Ring-shaped forceps
Scissors, Micro scissors
Suture needle Akiyama MEDICAL MFG. CO F17-40B2
Xylazine Bayer Seractal
Preparations for Slice culture
10-cm plastic petri dish greiner 664160-013
35-mm plastic petri dish greiner 627160
Culture insert Millipore PICM01250
DMEM/F12 invitrogen 11039-021
Fetal Bovine Serum Sigma 172012-500ML
Fine forceps DUMONT INOX No.5
Forceps
Horse Serum Gibco 16050-122
Micro surgical knife Alcon 19 Gauge V-Lance
Multi-gas incubator Panasonic MCO-5MUV-PJ
N2/B27 media Made in-house ref. NPC dissociatioin culture
PBS Nacalai Tesque 14249-24
Ring-shaped forceps
Scissors, Micro scissors
Silicon rubber cutting board Made in-house
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. Basic helix-loop-helix factors in cortical development. Neuron. 39, 13-25 (2003).
  2. Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development. Developmental Neuroscience. 30, 24-32 (2007).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  4. Paridaen, J. T., Huttner, W. B. Neurogenesis during development of the vertebrate central nervous system. EMBO Reports. 15, 351-364 (2014).
  5. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  6. Louvi, A., Artavanis-Tsakonas, S. Notch signaling in vertebrate neural development. Nature Reviews Neuroscience. 7, 93-102 (2006).
  7. Pierfelice, T., Alberi, L., Gaiano, N. Notch in the Vertebrate Nervous System: An Old Dog with New Tricks. Neuron. 69, 840-855 (2011).
  8. Bray, S. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 678-689 (2006).
  9. Bray, S. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 722-735 (2016).
  10. Kopan, R., Ilagan, M. X. G. The Canonical Notch Signaling Pathway: Unfolding the Activation Mechanism. Cell. 137, 216-233 (2009).
  11. Ishibashi, M., et al. Persistent expression of helix-loop-helix factor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in the central nervous system. The EMBO Journal. 13, 1799-1805 (1994).
  12. Ohtsuka, T., et al. Hes1 and Hes5 as notch effectors in mammalian neuronal differentiation. The EMBO Journal. 18, 2196-2207 (1999).
  13. Ohtsuka, T., Sakamoto, M., Guillemot, F., Kageyama, R. Roles of the Basic Helix-Loop-Helix Genes Hes1 and Hes5 in Expansion of Neural Stem Cells of the Developing Brain. Journal of Biological Chemistry. 276, 30467-30474 (2001).
  14. Kageyama, R., Ohtsuka, T., Kobayashi, T. The Hes gene family: repressors and oscillators that orchestrate embryogenesis. Development. 134, 1243-1251 (2007).
  15. Shimojo, H., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Oscillations in Notch Signaling Regulate Maintenance of Neural Progenitors. Neuron. 58, 52-64 (2008).
  16. Imayoshi, I., et al. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
  17. Shimojo, H., et al. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes and Development. 30, 102-116 (2016).
  18. Hirata, H., et al. Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop. Science. 298, 840-843 (2002).
  19. Kageyama, R., Ohtsuka, T., Shimojo, H., Imayoshi, I. Dynamic Notch signaling in neural progenitor cells and a revised view of lateral inhibition. Nature Neuroscience. 11, 1247-1251 (2008).
  20. Masamizu, Y., et al. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1313-1318 (2006).
  21. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342, 1193-1200 (2013).
  22. Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152, 945-956 (2013).
  23. Luker, G. D., Pica, C. M., Song, J., Luker, K. E., Piwnica-Worms, D. Imaging 26S proteasome activity and inhibition in living mice. Nature Medicine. 9, 969-973 (2003).
  24. Yamaguchi, S., et al. Synchronization of Cellular Clocks in the Suprachiasmatic Nucleus. Science. 302, 1408-1412 (2003).
  25. Kiyohara, Y. B., et al. The BMAL1 C terminus regulates the circadian transcription feedback loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10074-10079 (2006).
  26. Behar, M., Hoffmann, A. Understanding the temporal codes of intra-cellular signals. Current Opinion in Genetics and Development. 20, 684-693 (2010).
  27. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic Gene Expression in a Single Cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
  28. Nelson, D. E., et al. Oscillations in NF-kappaB signaling control the dynamics of gene expression. Science. 306, 704-708 (2004).
  29. Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
  30. Hansen, A. S., O’Shea, E. K. Promoter decoding of transcription factor dynamics involves a trade-off between noise and control of gene expression. Molecular Systems Biology. 9, 704 (2014).
  31. Hansen, A. S., O’Shea, E. K. cis Determinants of Promoter Threshold and Activation Timescale. Cell Reports. 12, 1226-1233 (2015).
  32. Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Signaling Dynamics Control Cell Fate in the Early Drosophila Embryo. Developmental Cell. 48, 361-370 (2019).
  33. Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: Progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
  34. Nakajima, Y., Ohmiya, Y. Bioluminescence assays: multicolor luciferase assay, secreted luciferase assay and imaging luciferase assay. Expert Opinion on Drug Discovery. 5, 835-849 (2010).
  35. Nakajima, Y., et al. Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One. 5, (2010).
  36. Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Molecular Imaging. 12, (2013).

Tags

Keywords: Bioluminescence ImagingNotch SignalingNeurogenesisNeural Progenitor CellsDll1 ReporterIn Vivo ImagingReal-time Gene ExpressionCell ProliferationCell DifferentiationEmbryonic Development
check_url/60455?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Shimojo, H., Kageyama, R. Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis. J. Vis. Exp. (154), e60455, doi:10.3791/60455 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image