Summary

Echtzeit-Biolumineszenz-Bildgebung der Notch-Signaldynamik während der murinen Neurogenese

Published: December 12, 2019
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Summary

Neurale Stamm-/Vorläuferzellen weisen verschiedene Expressionsdynamiken von Notch-Signalkomponenten auf, die zu unterschiedlichen Ergebnissen zellulärer Ereignisse führen. Eine solche dynamische Expression kann durch Echtzeitüberwachung und nicht durch statische Analyse mit einem hochempfindlichen Biolumineszenz-Bildgebungssystem, das die Visualisierung schneller Veränderungen von Genausdrücken ermöglicht, aufgedeckt werden.

Abstract

Die Notch-Signalisierung reguliert die Aufrechterhaltung von neuronalen Stamm-/Vorläuferzellen durch Zell-Zell-Wechselwirkungen. Die Komponenten der Notch-Signalisierung weisen einen dynamischen Ausdruck auf. Notch-Signaleffektor Hes1 und der Kerbliganand Delta-like1 (Dll1) werden oszillatonisch in neuralen Stamm-/Vorläuferzellen exprimiert. Da die Periode der oszillatorischen Expression dieser Gene sehr kurz ist (2 h), ist es schwierig, ihre zyklische Expression zu überwachen. Um solche schnellen Veränderungen in der Genexpression oder Proteindynamik zu untersuchen, sind schnell reagierende Reporter erforderlich. Aufgrund seiner schnellen Reifungskinetik und hohen Empfindlichkeit eignet sich der Biolumineszenzreporter luciferase, um schnelle Genexpressionsänderungen in lebenden Zellen zu überwachen. Wir verwendeten einen destabilisierten Luziferase-Reporter zur Überwachung der Promotoraktivität und einen luziferase-gebundenen Reporter zur Visualisierung der Proteindynamik bei Einzelzellauflösung. Diese Biolumineszenz-Reporter zeigen einen schnellen Umsatz und erzeugen sehr schwache Signale; Daher haben wir ein hochempfindliches Biolumineszenz-Bildgebungssystem entwickelt, um solche schwachen Signale zu erkennen. Diese Methoden ermöglichen es uns, verschiedene Genexpressionsdynamiken in lebenden Zellen und Geweben zu überwachen, die wichtige Informationen sind, um die tatsächlichen Zellzustände zu verstehen.

Introduction

Das Säugetiergehirn besteht aus einer großen Anzahl von verschiedenen Arten von Neuronen und Gliazellen. Alle Zellen werden aus neuronalen Stamm-/Vorläuferzellen (NPCs) erzeugt, die sich zuerst vermehren, um ihre Anzahl zu erweitern, dann beginnen, sich in Neuronen zu differenzieren, und schließlich zu Gliazellen1,2,3,4,5führen. Sobald sich die Zellen in Neuronen differenziert haben, können sie sich nicht vermehren oder ihre Anzahl erhöhen, und daher ist die Aufrechterhaltung von NPCs bis zu späteren Stadien wichtig. Die Notch-Signalisierung über Zell-Zell-Interaktionen spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der NPCs6,7. Kerbliganden interagieren mit dem Membranprotein Notch auf der Oberfläche benachbarter Zellen und aktivieren das Kerbprotein. Nach der Aktivierung tritt eine Proteolyse des Kerbproteins auf, wodurch die intrazelluläre Domäne von Notch (NICD) aus der Zellmembran in den Zellkern8,9,10freigesetzt wird. Im Kern bindet NICD an die Förderregionen Hes1 und Hes5 (Hes1/5) und aktiviert die Expression dieser Gene. Hes1/5 unterdrücken die Expression der proneuralen Gene Ascl1 und Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14. Da proneurale Gene neuronale Differenzierung induzieren, spielen Hes1/5 eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung von NPCs. Da proneurale Gene die Expression des Kerbliganden Delta-like1 (Dll1) aktivieren können, reprimiert Hes1/5 auch die Expression von Dll1. Daher führt die Expression von Dll1 dazu, dass benachbarte Zellen für Dll1 über Notch-Signalisierung negativ sind. Auf diese Weise hemmen Zellen benachbarte Zellen daran, ihrem gleichen Schicksal zu folgen, ein Phänomen, das als laterale Hemmung bekannt ist8. Im sich entwickelnden Gehirn spielt die laterale Hemmung eine Rolle bei der Erzeugung verschiedener Zelltypen.

Die Echtzeit-Bildgebung auf Einzelzellebene zeigt dynamische Ausdrücke der Komponenten der Notch-Signalisierung in NPCs15,16,17. Notch Signalisierung aktiviert die Expression von Hes1, aber Hes1 Protein bindet an seinen eigenen Promotor und unterdrückt seinen eigenen Ausdruck. Darüber hinaus ist Hes1 ein extrem instabiles Protein, das durch den Ubiquitin-Proteasomen-Weg abgebaut wird; Daher ist die Repression des eigenen Förderers nur von kurzer Dauer und dann beginnt die Transkription wieder. Auf diese Weise oszilliert der Ausdruck von Hes1 sowohl auf der Transkriptions- als auch auf der Translationsebene in einem 2 h-Zyklus18. Die oszillierende Expression von Hes1 wiederum induziert die oszillierende Expression der nachgeschalteten Zielgene, wie Ascl1, Neurog2 und Dll1, durch periodische Repression15,16,17,19. Während proneurale Gene neuronale Differenzierung induzieren können, reicht ihre oszillierende Expression für eine neuronale Differenzierung nicht aus; vielmehr ist ihr nachhaltiger Ausdruck für die neuronale Differenzierung unerlässlich. Die oszillatorische Expression von proneuralen Genen ist wichtig für die Aufrechterhaltung von NPCs und nicht für die Induktion neuronaler Differenzierung14,15,16. Die Expression von Dll1 oszilliert sowohl auf Transkriptions- als auch auf Translationsebene während verschiedener Morphogenese, wie Neurogenese und Somitogenese. Die dynamische Expression von Dll1 ist wichtig für die normale Morphogenese und die stetige Expression von Dll1 induziert Defekte in der Neurogenese und Sogenese17. Diese Ergebnisse zeigen die wichtige Funktion, die die Dynamik der Genexpression und Proteinkinetik auf die Regulation verschiedener Entwicklungsereignisse hat (d.h. unterschiedliche Expressionsdynamiken erzeugen unterschiedliche Outputs im zellulären Verhalten).

Um die Dynamik der Notch-Signalisierung zu analysieren, reicht die statische Analyse von Geweben und Zellen nicht aus, da sie sich ständig ändern. Die Echtzeit-Bildgebung einzelner Zellen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Dynamik in der Genexpression zu offenbaren. Die dynamische Expression von Notch-Signalmolekülen erfährt im Zeitraum von 2-3 h schnelle zyklische Reaktionen. Diese schnelle periodische Expression stellt die Echtzeitüberwachung vor zwei schwierige Probleme: (1) Die Expression der Moleküle wird auf ein niedriges Niveau unterdrückt, und (2) ein schneller Fluktuation erfordert schnell reagierende Reporter. Um diese Probleme zu überwinden, haben wir zuvor eine Biolumineszenz-Echtzeit-Bildgebungsmethode20entwickelt. Da der Biolumineszenzreporter eine höhere Empfindlichkeit und kürzere Reifezeit hat als fluoreszierende Reporter, ermöglicht uns diese Strategie, die schnelle Dynamik in lebenden Zellen zu überwachen. Anhand der Echtzeit-Visualisierung stellten wir fest, dass mehr Gene eine dynamische Expression aufwiesen, als wir bisher dachten. Darüber hinaus hat die Zahl der Berichte, die Expression und Proteindynamik in lebenden Zellen und die Bedeutung dieser Dynamik in verschiedenen biologischen Ereignissen zeigen, zugenommen, was auf eine grundlegende Rolle der Dynamik in den Genausdrücken21,22hindeutet.

In diesem Bericht beschreiben wir eine Möglichkeit, den Ausdruck der Kerb Liganden Dll1 in NPCs sowohl in dissoziierten Kulturen als auch in kortikalen Scheibenkulturen zu visualisieren. Um die Dynamik der Dll1-Transkription auf Einzelzellebenen zu überwachen, erzeugten wir dissoziierte Kulturen von NPCs, die aus dem embryonalen Telencephalon von transgenen Mäusen abgeleitet wurden, die pDll1-Ub-Fluc-Reporter trugen, einen Dll1-Promotor-gesteuerten destabilisierten Luziferase-Reporter. Um die Dll1-Proteindynamik in vivo zu überwachen, führten wir den Dll1-Fluc-Fusionsreporter in NPCs im Kortex ein und visualisierten den Ausdruck des Reporters in NPCs in kortikalen Scheibenkulturen. Die Echtzeit-Bildgebung ermöglichte es uns, die verschiedenen Merkmale der Genexpression und Proteindynamik in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher Auflösung zu erfassen.

Protocol

Alle Verfahren einschließlich tierischer Fächer wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee am Institut für Grenzleben und Medizinische Wissenschaften der Universität Kyoto genehmigt. 1. Biolumineszenz-Reporter HINWEIS: Der luziferase-Reporter eignet sich zur Messung der schnellen Dynamik der Promotoraktivität durch Verschmelzung des Degradationssignals. Darüber hinaus ermöglicht der luziferase Fusion Reporter die Überwachung der Proteindynamik in d…

Representative Results

Ausdrücke der Gene Hes1/7 weisen 2 h Oszillationszyklus in verschiedenen Zelllinien und während der Sonogenese auf. Darüber hinaus ist die Schwingungsdauer sehr kurz und sowohl ihre mRNAs als auch ihre Proteine sind mit einer Halbwertszeit von etwa 20 min extrem instabil. Wenn wir einen Reporter mit langsamer Reaktion verwenden, können wir eine solche schnelle Dynamik nicht verfolgen, und wenn wir einen stabilen Reporter verwenden, akkumuliert er sich allmählich, während die Genexpression oszilliert. Daher…

Discussion

Die Komponenten der Notch-Signalisierung zeigen oszillatorischen Ausdrücke synchron während der Synchronität während der Neurogenese, was zu den Schwierigkeiten führt, die Expressionsdynamik durch statische Analyse im letzteren Fall zu erfassen. Daher ist eine Echtzeitüberwachung erforderlich, um die Ausdrucksdynamik von Notch-Signalkomponenten wie Hes1 und Dll1zu zeigen. Da die Perioden der Ausdrücke von Hes1 und Dll1 Schwingungen extrem kurz sind, etwa 2-3 h, sind schnelle Rea…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Yumiko Iwamoto für die Unterstützung der Produktion des Videos. Wir sind auch Akihiro Isomura für die Diskussion und Unterstützung der Bildanalyse, Hitoshi Miyachi für technische Unterstützung für die Erzeugung von transgenen Tieren, Yuji Shinjo (Olympus Medical Science), Masatoshi Egawa (Olympus Medical Science), Takuya Ishizu ( Olympus Medical Science) und Ouin Kunitaki (Andor Japan) für die technische Unterstützung und Diskussionen des Biolumineszenz-Bildgebungssystems. Diese Arbeit wurde unterstützt von Core Research for Evolutional Science and Technology (JPMJCR12W2) (R.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (MEXT 24116705 for H.S. and MEXT 16H06480 for R.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (JSPS 18K06254) (H.S.), Takeda Foundation (R.K. und H.S.) und Platform for Dynamic Approaches to Living System aus dem Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie, Japan.

Materials

Bioluminescence Imaging System
Chilled water circulator (chiller) Julabo Model: F12-ED
Cooled CCD camera Andor Technology Model: iKon-M 934
Incubator system TOKAI HIT Model: INU-ONICS
Inverted microscope Olympus Model: IX81
Inverted microscope Olympus Model: IX83
LED illumination device CoolLED Model: pE1
MetaMorph MOLECULAR DEVICES Model: 40000
Mix gas controller Tokken Model: TK-MIGM OLO2
Objective lens Olympus Model: UPLFLN 40X O
Preparations for Dissection
Dissection microscope Nikon Model: SMZ-2B
Fluorescence stereoscopic microscope Leica Model: MZ16FA
Fine forceps DUMONT INOX No.5
Scissors, Micro scissors
Forceps
Ring-shaped forceps
10-cm plastic petri dish greiner 664160-013
35-mm plastic petri dish greiner 627160
PBS Nacalai Tesque 14249-24
DMEM/F12 invitrogen 11039-021
Reagents for NPC dissociation culture
B27 supplement invitrogen 12587-010
bFGF invitrogen 13256-029 Stock solution: 1 μg/ml in 0.1% BSA/PBS
D-luciferin Nacalai Tesque 01493-85 Stock solution: 100mM in 0.9% saline
DNase Worthington Biochemical Corporation LK003172 Stock solution: 1000U/ml in EBSS
EBSS Worthington Biochemical Corporation LK003188
Glass bottom dish IWAKI 3910-035
N2 supplement (100x) invitrogen 17502-048
N-acetyl-cystein Sigma A-9165-25G
Papain Worthington Biochemical Corporation LK003178 Stock solution: 7U/ml in EBSS
Penicillin/Streptmycine Nacalai Tesque 09367-34
Poly-L-lysine Sigma P-6281 40 mg/ml in DW
Preparations for in utero electroporation
50-ml syringe TERUMO 181228T
Electrode Neppagene 7-mm
Electroporator Neppagene CUY21 EDIT
Forceps
Gauzes Kawamoto co. 7161
Micro capillary Made in-house
PBS Nacalai Tesque 14249-24
Pentbarbital Kyoritsuseiyaku Somnopentyl
Ring-shaped forceps
Scissors, Micro scissors
Suture needle Akiyama MEDICAL MFG. CO F17-40B2
Xylazine Bayer Seractal
Preparations for Slice culture
10-cm plastic petri dish greiner 664160-013
35-mm plastic petri dish greiner 627160
Culture insert Millipore PICM01250
DMEM/F12 invitrogen 11039-021
Fetal Bovine Serum Sigma 172012-500ML
Fine forceps DUMONT INOX No.5
Forceps
Horse Serum Gibco 16050-122
Micro surgical knife Alcon 19 Gauge V-Lance
Multi-gas incubator Panasonic MCO-5MUV-PJ
N2/B27 media Made in-house ref. NPC dissociatioin culture
PBS Nacalai Tesque 14249-24
Ring-shaped forceps
Scissors, Micro scissors
Silicon rubber cutting board Made in-house

References

  1. Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. Basic helix-loop-helix factors in cortical development. Neuron. 39, 13-25 (2003).
  2. Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development. Developmental Neuroscience. 30, 24-32 (2007).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  4. Paridaen, J. T., Huttner, W. B. Neurogenesis during development of the vertebrate central nervous system. EMBO Reports. 15, 351-364 (2014).
  5. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  6. Louvi, A., Artavanis-Tsakonas, S. Notch signaling in vertebrate neural development. Nature Reviews Neuroscience. 7, 93-102 (2006).
  7. Pierfelice, T., Alberi, L., Gaiano, N. Notch in the Vertebrate Nervous System: An Old Dog with New Tricks. Neuron. 69, 840-855 (2011).
  8. Bray, S. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 678-689 (2006).
  9. Bray, S. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 722-735 (2016).
  10. Kopan, R., Ilagan, M. X. G. The Canonical Notch Signaling Pathway: Unfolding the Activation Mechanism. Cell. 137, 216-233 (2009).
  11. Ishibashi, M., et al. Persistent expression of helix-loop-helix factor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in the central nervous system. The EMBO Journal. 13, 1799-1805 (1994).
  12. Ohtsuka, T., et al. Hes1 and Hes5 as notch effectors in mammalian neuronal differentiation. The EMBO Journal. 18, 2196-2207 (1999).
  13. Ohtsuka, T., Sakamoto, M., Guillemot, F., Kageyama, R. Roles of the Basic Helix-Loop-Helix Genes Hes1 and Hes5 in Expansion of Neural Stem Cells of the Developing Brain. Journal of Biological Chemistry. 276, 30467-30474 (2001).
  14. Kageyama, R., Ohtsuka, T., Kobayashi, T. The Hes gene family: repressors and oscillators that orchestrate embryogenesis. Development. 134, 1243-1251 (2007).
  15. Shimojo, H., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Oscillations in Notch Signaling Regulate Maintenance of Neural Progenitors. Neuron. 58, 52-64 (2008).
  16. Imayoshi, I., et al. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
  17. Shimojo, H., et al. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes and Development. 30, 102-116 (2016).
  18. Hirata, H., et al. Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop. Science. 298, 840-843 (2002).
  19. Kageyama, R., Ohtsuka, T., Shimojo, H., Imayoshi, I. Dynamic Notch signaling in neural progenitor cells and a revised view of lateral inhibition. Nature Neuroscience. 11, 1247-1251 (2008).
  20. Masamizu, Y., et al. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1313-1318 (2006).
  21. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342, 1193-1200 (2013).
  22. Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152, 945-956 (2013).
  23. Luker, G. D., Pica, C. M., Song, J., Luker, K. E., Piwnica-Worms, D. Imaging 26S proteasome activity and inhibition in living mice. Nature Medicine. 9, 969-973 (2003).
  24. Yamaguchi, S., et al. Synchronization of Cellular Clocks in the Suprachiasmatic Nucleus. Science. 302, 1408-1412 (2003).
  25. Kiyohara, Y. B., et al. The BMAL1 C terminus regulates the circadian transcription feedback loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10074-10079 (2006).
  26. Behar, M., Hoffmann, A. Understanding the temporal codes of intra-cellular signals. Current Opinion in Genetics and Development. 20, 684-693 (2010).
  27. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic Gene Expression in a Single Cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
  28. Nelson, D. E., et al. Oscillations in NF-kappaB signaling control the dynamics of gene expression. Science. 306, 704-708 (2004).
  29. Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
  30. Hansen, A. S., O’Shea, E. K. Promoter decoding of transcription factor dynamics involves a trade-off between noise and control of gene expression. Molecular Systems Biology. 9, 704 (2014).
  31. Hansen, A. S., O’Shea, E. K. cis Determinants of Promoter Threshold and Activation Timescale. Cell Reports. 12, 1226-1233 (2015).
  32. Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Signaling Dynamics Control Cell Fate in the Early Drosophila Embryo. Developmental Cell. 48, 361-370 (2019).
  33. Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: Progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
  34. Nakajima, Y., Ohmiya, Y. Bioluminescence assays: multicolor luciferase assay, secreted luciferase assay and imaging luciferase assay. Expert Opinion on Drug Discovery. 5, 835-849 (2010).
  35. Nakajima, Y., et al. Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One. 5, (2010).
  36. Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Molecular Imaging. 12, (2013).

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Cite This Article
Shimojo, H., Kageyama, R. Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis. J. Vis. Exp. (154), e60455, doi:10.3791/60455 (2019).

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